一种海南捕鸟蛛毒素iii的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及固相多肽合成，尤其涉及一种海南捕鸟蛛毒素 III的固相制备方法。
【背景技术】
[0002] 海南捕鸟蛛毒素 III是从海南捕鸟蛛中分离的多肽类毒素分子，33个氨基酸残 基，分子量3609 Da，三对二硫键，海南捕鸟蛛毒素 III是一种TTX-S型钠通道抑制剂，对电 压门控钠通道NavL 7有高选择性抑制活性，海南捕鸟蛛毒素 III有望开发成一种特异性 NavL 7电压门控钠通道抑制剂。
[0003] 电压门控钠通道NavL 7在神经性疼痛和炎性疼痛传导过程中具有十分重要的作 用，抑制电压门控钠通道NavL 7的活性能够抑制痛觉的产生，因此，开发电压门控钠通道 NavL 7高选择性抑制剂有望产生镇痛活性强，毒副作用小的镇痛药。
[0004] 海南捕鸟蛛毒素 III作为一种高特异性电压门控钠通道NavL 7抑制剂，可望形成 一种新型镇痛药物，然而，海南捕鸟蛛毒素 III天然毒素获得十分困难，限制了其研宄和应 用，本发明提供一种大规模制备海南捕鸟蛛毒素 III的制备方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种获得高活性的海南捕鸟蛛毒素 III的固相多肽合成 方法，以替代天然提取。
[0006] 为了实现以上目的，提供一种海南捕鸟蛛毒素 III的制备方法，包括如下步骤： A) 选用Rink Amide树脂，利用Fmoc氨基保护和侧链保护氨基酸为原料，按照海南捕鸟 蛛毒素 III的序列依次固相合成，第2位和第17位半胱氨酸采用Fmoc-Cys(Mmt)-OH ; B) 多肽序列合成完成后，采用1-3% TFA选择性去Mmt保护； C) 采用空气氧化法在树脂上第2位和第17位半胱氨酸形成二硫键； D) 90% TFA裂解树脂获得含一对二硫键多肽，制备色谱纯化，冷冻干燥； E) 纯化的含一对二硫键多肽采用固相DTNB氧化复性，形成第二对和第三对二硫键； F) 制备色谱纯化，冷冻干燥获得海南捕鸟蛛毒素 III纯品。
[0007] 采用上述技术方案，通过固相多肽合成法合成海南捕鸟蛛毒素 III，具有操作简 单，成本低廉，产品回收率高等优点，适合大规模生产。
[0008] 作为本发明的进一步改进，所述步骤A)中，所用Rink Amide树脂替代度为 0.3-0. 8 mmol/g〇
[0009] 作为本发明的进一步改进，所述步骤A)中，依次偶联采用的偶联剂为NMM/HATU/ HOBt ;每步的去Fmoc基团试剂为20%哌啶/DMF溶液。
[0010] 作为本发明的进一步改进，所述步骤B)中，采用1-3% TFA选择性去Mmt保护，去 保护时间为30-10分钟。
[0011] 作为本发明的进一步改进，所述步骤C)中，采用空气氧化法在树脂上第2位和第 17位半胱氨酸形成二硫键，反应缓冲液为0.1 M磷酸缓冲液，pH值为7. 5,反应时间为24-96 小时，反应程度采用DTNB检测，多肽树脂在DTNB溶液中不再变黄为反应终点。
[0012] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D)中，裂解采用裂解试剂：90%TFA/5%苯酚 /2. 5%TIS/2。5%水，每克树脂加入3 mL裂解试剂，裂解时间2小时。
[0013] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D)和F)中，纯化采用制备色谱纯化，色谱柱 采用C18柱，柱温40°C。
[0014] 作为本发明的进一步改进，所述步骤E)中，采用固相DTNB氧化法，缓冲液为0.1 M 磷酸缓冲液，pH值为7. 5,复性时间通过复性率确定或者复性时间为24-96小时。
[0015] 说明书附图 图1为海南捕鸟蛛毒素 III制备流程图。
[0016]
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0018] Rink Amide树脂、各种保护氨基酸以及偶联剂均购自上海吉尔生化有限公司，说 明书和权利要求书中所用英文缩写的含义见下表。
[0019] 实施例一海南捕鸟蛛毒素 III肽链的合成 称取替代值〇. 5 mmol/g Rink Amide树脂20克，DMF膨化30分钟，抽干，加入20%哌啶 30 mL去保护15分钟，抽干，加入30 mL DMF清洗1次，加入20%哌啶30 ml去保护10分 钟，用DMF清洗5次，按照肽链氨基酸残基序列依次完成Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr (tBu) -OH， Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-〇H, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Mmt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu (OtBu)-〇H，Fmoc-Asn (Trt)-〇H，Fmoc-Lys (Boc)-〇H，Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Thr (tBu)-〇H，Fmoc-Cys (Trt)-〇H，Fmoc-Ser(tBu)-〇H，Fmoc-Asp(OtBu)-〇H， Fmoc-Gly-〇H， Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Gly-〇H， Fmoc-Lys(Boc)-〇H， Fmoc-Cys(Mmt)-〇H， Fmoc-Gly-OH的偶联。偶联采用NMM/HATU/HOBt体系，反应溶剂为DMF，合成完成后用DMF 清洗5次，用DCM清洗3次。
[0020] 实施例二海南捕鸟蛛毒素 III肽树脂去Mmt保护 实施例一合成的海南捕鸟蛛毒素 III肽树脂用20%哌啶/DMF去保护，用DMF清洗5 次，用DCM清洗3次，氮气吹干，加入3% TFA/DCM溶液600毫升，反应时间10分钟，除溶液， 用DMF清洗5次，用DCM清洗5次，氮气吹干。
[0021] 实施例三海南捕鸟蛛毒素 III肽树脂空气氧化法氧化形成一对二硫键 实施例二获得的去Mmt保护基海南捕鸟蛛毒素 III肽树脂，加入1000毫升0.1 M磷酸 缓冲液，PH值为7. 5,反应时通空气，反应温度为室温，反应时间依据氧化进程确定，氧化反 应24小时后开始取肽树脂检测，将肽树脂用水洗干净后加入DTNB溶液中，溶液不变黄为反 应终点。
[0022] 实施例四海南捕鸟蛛毒素 III肽树脂裂解 实施例四获得的肽树脂，加入裂解试剂（TFA:450 mL，苯酚：50 mL，TIS:25 mL，水：25 mL)，室温裂解2小时，收集裂解液，用TFA清洗树脂，合并，氮气吹干，样品采用乙酸水溶液 溶解，冻干。
[0023] 实施例五含一对二硫键海南捕鸟蛛毒素 III纯化 实施例四获得的多肽采用高效液相色谱纯化，色谱柱为C18制备柱（7. 6*250 mm)，流 速4mL/min流动相A液为0. 1%TFA水溶液，流动相B液为0. 1%TFA乙腈溶液，柱温40°C，采 用梯度方式洗脱：初始梯度A为90%，35分钟内降为55%，收集产品峰，冻干，计算收率，含一 对二硫键海南捕鸟蛛毒素 III保留时间为21. 6分钟，收率57. 5%。
[0024] 实施例六海南捕鸟蛛毒素 III复性 实施例五获得的多肽1克，加入1000毫升0.1 M磷酸缓冲液溶解多肽，加入500毫升 乙腈，加入500毫升甲醇后混匀，加入100克固相DTNB，室温氧化复性，24小时后检测复性 效率，待目的峰峰值不再增加后停止复性。
[0025] 实施例七海南捕鸟蛛毒素 III纯化 实施例六获得的多肽采用高效液相色谱纯化，色谱柱为C18制备柱（7. 6*250 mm)，流 速4mL/min流动相A液为0. 1%TFA水溶液，流动相B液为0. 1%TFA乙腈溶液，柱温40°C，采 用梯度方式洗脱：初始梯度A为90%，35分钟内降为55%，收集产品峰，冻干，计算收率，含一 对二硫键海南捕鸟蛛毒素 III保留时间为19. 7分钟，收率74. 2%。
[0026] 以上内容是结合优选的实施方式进行的具体说明，对于本发明所属技术领域的技 术人员，在本发明的技术思路上还可以做出若干推演，都应当视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 选用RinkAmide树脂，利用Fmoc氨基保护和侧链保护氨基酸为原料，按照海南捕鸟蛛 毒素III的序列依次固相合成，第2位和第17位半胱氨酸采用Fmoc-Cys(Mmt)-OH; 多肽序列合成完成后，采用1-3%TFA选择性去Mmt保护； 采用空气氧化法在树脂上第2位和第17位半胱氨酸形成二硫键； 90%TFA裂解树脂获得含一对二硫键多肽，制备色谱纯化，冷冻干燥； 纯化的含一对二硫键多肽采用固相DTNB氧化复性，形成第二对和第三对二硫键； 制备色谱纯化，冷冻干燥获得海南捕鸟蛛毒素III纯品。2. 如权利要求1所述的海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：所述步骤A)中 所述RinkAmide树脂替代度为0? 3-0. 8mmoL/g。3. 如权利要求1所述的海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：所述步骤A)中 所述依次偶联采用HATU/HOBt/NMM，每步的脱保护试剂为20%哌啶/DMF溶液。4. 如权利要求1所述的海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：所述步骤B)中 所述选择性去Mmt保护采用1-3%TFA，去保护时间为30-10分钟。5. 如权利要求1所述的海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：所述步骤C)中 所述二硫键形成采用空气氧化法。6. 如权利要求1所述的海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：所述步骤D)中 所述多肽从树脂上裂解下来采用90%TFA/5%苯酚/2. 5%TIS/2. 5%水。7. 如权利要求1所述的海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：所述步骤D)和 F)中所述多肽纯化采用制备色谱进行纯化，色谱柱为C18柱，A液为0.1%TFA水溶液，B液 为0.1%TFA乙腈溶液，梯度洗脱，检测波长为280nm，收集产物，冷冻干燥。8. 如权利要求1所述的海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，其特征在于：所述步骤E)中 所述第二对和第三对二硫键的形成采用固相DTNP氧化。
【专利摘要】本发明提供一种海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，属多肽及蛋白质制备领域，海南捕鸟蛛毒素III采用Fmoc法固相多肽合成方法合成，合成树脂为Rink amide树脂，第2位和第17位半胱氨酸采用Fmoc-Cys(Mmt)-OH，其余位置的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(Trt)-OH，多肽链合成完毕后用3% TFA去Mmt保护，第2位和第17位半胱氨酸二硫键形成采用空气氧化法，形成第一对二硫键后多肽从树脂上裂解下来，第二对和第三对二硫键的形成采用固相DTNB氧化法，最终形成有生理活性的海南捕鸟蛛毒素III。本发明方法制备的海南捕鸟蛛毒素III生理活性和天然毒素活性一致，合成效率高。
【IPC分类】C07K14/435, C07K1/06, C07K1/04
【公开号】CN104892745
【申请号】CN201510331818
【发明人】刘宇
【申请人】湖南理工学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日