利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种莱茵衣藻除细菌与真菌的方法，特别是一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法。
【背景技术】
[0002]莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种真核单细胞微藻，具有生长周期短，易于培养，基因组已被注释，相关遗传生化技术与分子生物学技术成熟，具备重金属吸附能力，油脂生产量高等特点，而被作为生命科学研宄与应用的模式生物，目前已经开展了纤毛类疾病模型衣藻的研宄，以及生物柴油与生物去污的研宄。然而在科学研宄与应用过程中不可避免的在接种的时候造成衣藻藻种的污染问题，而这些杂菌污染会危及到衣藻藻种的保存，特别是稀有藻种，以及影响研宄结果的准确性。
[0003]以往的除菌方法包括物理方法与化学方法；
[0004]在物理方法中，常用单克隆划线或铺板法与离心沉淀洗脱法。单克隆划线法要求将杂菌污染的衣藻藻种挑取少许进行培养基平板划线，单克隆铺板法要求将杂菌污染的衣藻藻种使用少许液体培养基重悬后再铺平板，培养数日，二者都将使得衣藻细胞与污染杂菌分离，将未污染衣藻单克隆细胞挑出至新的平板，保种。离心沉淀洗脱法要求将杂菌污染的衣藻藻种使用液体培养基重悬后进行低速离心^OOg)，使得衣藻细胞体沉淀至底部，去除上清污染液，可多次洗涤沉淀，最后铺板，培养数日，将未污染衣藻单克隆细胞挑出至新的平板，保种。但是上诉常用的物理方法对于污染严重的衣藻藻种的成功率很低，并且离心沉淀洗脱法对于具有高粘附性细菌也是不起作用的。
[0005]在化学方法中，Mahan等研宄者发现使用20?40ug/mL的多菌灵、甲基托布津、苯菌灵三种苯并咪唑类除真菌剂均可有效去除衣藻的真菌污染(Mahan, 2005, B1Techniques) ;Kan等研宄者进一步研宄发现组合使用多菌灵(40ug/mL)、氨苄青霉素(500ug/mL)、头孢噻肟(100Ug/mL)可以有效去除混合细菌和真菌的污染(Kan, 2009, Journal of Phycology)。然而，现有化学去除杂菌的方法并不是持续有效的，特别是研宄环境中持续使用一种混合抗菌剂，会使细菌真菌产生抗性从而引起失效。
[0006]莱茵衣藻为Chlamydomonas reinhardtii，在实验室的条件下，易受到操作不当等因素导致细菌与真菌的污染，并且造成衣藻污染的情况复杂多变，污染的细菌真菌的种类不定。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是要提供一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法，解决在防治衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染的问题。
[0008]本发明的目的是这样实现的:该除菌方法如下:杂菌污染的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5°C, 14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行除菌培养5-8天，实现衣藻的除菌；所述的混合抗菌剂包括:10ug/ml抗真菌剂和15ug/ml抗细菌剂；所述的抗真菌剂为嘧菌酯，所述的抗细菌剂为萘啶酮酸。
[0009]所述的衣藻即实验藻种为:莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii。
[0010]所述TAP固体培养基平板为:TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner微量元素lml/L，乙酸lml/L，Tris 2.42g/L，琼脂粉15g/L，121°C高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用；所述的 TAP 盐溶液为:NH4Cl 15g/L, MgSO4.7H20 4g/L, CaCl2.2H20 2g/L ;所述的磷酸盐溶液为:K2HP04288g/L，KH2PO4144g/L ；Hutner微量元素为:EDTA 二钠盐50g/L, ZnSO4.7Η20 22g/L, H3BO3Il.4g/L, MnCl2.4Η20 5.06g/L, CoCl.6Η20 1.61 g/L, CuSO4.5Η201.57g/L, (NH4)6Mo7O24.4H20 1.1 g/L, FeSO4.7H20 4.99g/L，用 KOH 或者 HCl 调节 pH 至 7.0。
[0011]所述的含有混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为:抗真菌剂嘧菌酯使用终浓度10ug/ml，在上述TAP固体培养基配制时添加，抗细菌剂萘啶酮酸使用终浓度15ug/ml，在上述TAP固体培养基配制灭菌以后，冷却至约55°C后添加。
[0012]有益效果，由于采用了上述方案，利用抗真菌剂嘧菌酯与抗细菌剂萘啶酮酸混合进行衣藻杂菌去除。抗真菌剂嘧菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过抑制真菌呼吸作用，抑制能量合成而杀除真菌，对于卵菌纲、子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲均有较强的杀除能力，抗真菌范围广。抗细菌剂萘啶酮酸能够抑制细菌DNA的合成，具有宽广的抗菌谱。目前未见报道使用嘧菌酯与萘啶酮酸混合抗菌剂进行衣藻污染的去除，该方法具有广谱杀菌特性，适用于各个研宄环境下细菌真菌污染的去除，特别是对于多菌灵、氨苄青霉素、头孢噻肟混合除菌方法无效的衣藻污染藻种的除菌。本方法比多菌灵等混合除菌法的成本低，效果好，配制方便，应用价值高。该方法具有不抑制衣藻本身生长，并且除混合菌能力强，操作方法简便，易于推广应用等优点，能够有效防治衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染问题，达到了本发明的目的。
[0013]优点:分别利用嘧菌酯去除真菌、萘啶酮酸去除细菌污染的特性，有效解决利用莱茵衣藻进行科学实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，利于稀有莱茵衣藻藻种的保存以及排出杂菌对于科学实验的准确性的影响，所述的衣藻藻种是莱茵衣藻物种的各个品种，具有良好的应用前景。
[0014]1、该藻株种质资源丰富，基因组小，功能保守，遗传分析与生化分析简单，是进行生命科学研宄的常用模式生物，应用范围广。
[0015]2、除菌剂嘧菌酯与萘啶酮酸混合除菌效果较之前所报道的多菌灵与氨苄抗生素、头孢抗生素混合除菌效果要好，可以在使用后者混合除菌剂不能得到较好除菌效果时采用本方案。
[0016]3、为防止杂菌抗性产生，将本发明的除菌方案与多菌灵、氨苄抗生素、头孢抗生素混合除菌方案交替使用，能够达到最优效果。
[0017]4、本发明能有效解决利用莱茵衣藻进行科学实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，利于珍贵莱茵衣藻藻种的保存以及科学实验的准确性，具有很好的推广应用价值。
【附图说明】
[0018]图1是污染莱茵衣藻在普通TAP固体培养基平板上生长状况图。
[0019]图2是污染莱茵衣藻在多菌灵、氨苄抗生素、头孢抗生素混合除菌方案的平板上生长状况图。
[0020]图3是污染莱茵衣藻在本发明的嘧菌酯、萘啶酮酸混合除菌方案的平板上生长状况图。
[0021]图中，I未受到污染的衣藻；2?4受到不同种类菌污染的衣藻。
【具体实施方式】
[0022]该除菌方法如下:杂菌污染的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5°C, 14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行除菌培养5_8天，实现衣藻的除菌；所述的混合抗菌剂包括:10ug/ml抗真菌剂即啼菌醋和15ug/ml抗细菌剂即萘啶酮酸。
[0023]所述的衣藻即实验藻种为:莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii。
[0024]所述TAP固体培养基平板为:TAP盐溶液25ml/