一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素 酶的深绿木霉及其应用。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C. 3. I. 1. 73，ferulicacid esterase，FAE)又称肉桂酸醋酶，是 一种新型酶制剂，它主要以阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和木质素阿魏酸酯 为底物，破坏阿魏酸与多糖相连的酯键，从植物细胞壁中释放阿魏酸，让余下的多糖主链易 被降解，有效提高了含有大量木质纤维素和阿魏酸的副产品的营养价值。阿魏酸具有多种 生理功能如清除自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突 变、防癌、增强精子活力以及调节人体免疫等。因此，在食品工业中可利用该酶打断阿魏酸 与细胞壁材料如麸皮、秸杆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，获得功能性食 品基料。阿魏酸酯酶在食品工业中具有广阔的应用前景。
[0003] 在饲料工业中，农作物植物性的纤维原材料经过阿魏酸酯酶处理后，阿魏酸从植 物细胞壁的结构中游离出来，植物材料致密的细胞骨架结构受到破坏，打破了木质素、半纤 维素及纤维素之间的连接，这种疏松的植物性原料更容易被牲畜消化吸收利用，可显著提 高饲料的利用率。
[0004] 纤维素酶是一类能降解纤维素中β -1，4糖苷键的O-糖基化水解酶。在饲料业生 产中，纤维素酶作为一种新型的饲料添加剂，添加剂量一般在〇. 1% -〇. 3%。由于植物细胞 壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的，阻止了动物对植物细胞内营养物质的消化吸收， 纤维素酶能在动物体内分解结构复杂的纤维素，摧毁植物细胞壁并释放营养物质，生成易 于消化的葡萄糖，使饲料的利用率增大，同时增进酸度，激活胃蛋白酶，促进消化吸收；纤维 素酶还能显著减少动物肠道内大肠杆菌的数量并促进有益微生物的生长，改善肠道内菌群 平衡。
[0005] 目前已经筛选到多种分泌阿魏酸酯酶和纤维素酶的微生物菌株，包括真菌、 细菌和酵母。发现的产阿魏酸醋酶微生物主要有黑曲霉（Aaspergillusniger)、链霉 菌（如 Streptomycesavermitilis)、梭菌（如 Clostridiumthermocellum)、杆菌（如 Bacillussp.)、乳酸杆菌（Lactobacilli)、假单胞菌（如 Pseudomonasfluorescens) 等。但绝大多数阿魏酸醋酶从真菌中分离得到，如米曲霉（Aspergi I Iusoryzae)、 黑曲霉（Aspergillusniger)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、尖孢镰刀 菌（Fusariumoxysporum)、嗜热侧抱霉（Sporotrichumthermophile)、黄柄 曲霉（Aspergillusflavipes)、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、塔宾曲霉 (Aspergillustubingensis)、青霉类（Penicillium) 〇
[0006] 目前，阿魏酸酯酶在饲料工业中的需求很大，而应用于工业的阿魏酸酯酶主要来 源于黑曲霉，由于黑曲霉阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，在工业生产使用过 程中，阿魏酸酯酶酶活损失严重，很大程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温 纤维素酶的深绿木霉及其应用，该菌株具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、 发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸 碱稳定性好。
[0008] -种产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心CGMCC(地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号： CGMCC No. 8673。
[0009] 本发明所述的深绿木霉菌AWS26的筛选方法包括以下步骤：
[0010] 步骤1，采样及样品处理
[0011] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌的生理盐水的三角瓶中，以160r/min的转速室温振 荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理 20-30min，得土样浑浊液。
[0012] 步骤2,富集培养
[0013] 吸取2-4mL经高温处理后的土样浑浊液，加入至装有30-60mL富集培养基一的三 角瓶中，置于45-50°C、转速160-200r/min下恒温摇床中培养5-7d。然后无菌操作量取 30-50mL富集培养液至离心管中，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，以富集培养基 二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的三角瓶中，再次置于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0014] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠 0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5。121°C 15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0015] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5。121°C 15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0016] 无机盐营养液：NaN03 2. 0g，K2PO4 I. 5g，CaCl2 I. 5g，MgSO4 0· 3g，FeSO4 · 7H20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4) 2S04 5g，去离子水 1000mL。
[0017] 步骤3,初筛
[0018] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培养 箱中继续倒置培养2-4d。
[0019] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基。接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量0.1 %的刚果红染液，染色l-10min，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛平板上接种出来，进一步复筛。
[0020] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C，15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0021] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
[0022] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉1.5g，pH4. 5。121°C，灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐 渐变得不透明，在60-70 °C下倒入平板中。
[0023] 阿魏酸乙酯溶液配制：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离心管中，加入500 yLN、N_二甲 基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0024] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0025] 步骤4,复筛
[0026] 将初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45?恒温培养箱中培养 2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态