长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 硒是水产动物的必需微量元素之一，具有抗氧化，增强机体免疫能力，调节机体代 谢，增强繁殖能力，降低某些重金属中毒等功能。硒缺乏会造成鱼的谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)活性降低，机体抗氧化能力减弱，致使机体自由基堆积，防病抗病能力下降。硒能 显著提高水产动物的生长，增强水产动物的抵抗力，并且有机硒的效果要优于无机硒。
[0003] 酵母因为其生长速度快，培养方便，含有高达50 %以上的蛋白质，更富含丰富的B 族维生素（尤其是B1，B2)和众多对人体有益的矿物质，而成为了应用最广泛最安全的营养 微生物。对于一些微量营养元素，酵母还具有很强的富集作用，更能将有毒无机硒转化为被 无毒易吸收的有机硒，与其他的一些无机硒相比，富硒酵母存在以下几点优势：1.利用率 高；2.毒性低；3.营养价值高；4.硒含量高；5.生理活性高。因此利用酵母来富集硒是一 个安全又高效的办法，所以富硒酵母渐渐成为了目前科研中的研宄热点之一，目前实验室 应用较多的有：假丝酵母、裂殖酵母和一些酿酒酵母。而针对宿主动物筛选的内源益生菌可 以更好地竞争宿主肠道中的黏附位点，成为优势菌群并在停止摄入后具有持续定植功能。
[0004] 作为富硒酵母，富硒效率是评价其富硒性能的基本指标，包括酵母的生物量及有 机硒的转化率，而从原料利用与转化上来看，富硒条件是直接影响酵母富硒效率的重要因 素，因此确定富硒的最优发酵条件，可以有效地提高酵母的生物量及有机硒的转化率，综合 提高富硒效率，对富硒酵母的产品开发及生产应用具有实际指导意义。
[0005] 目前国内外常见的富硒酵母有酿酒酵母、汉逊酵母、假丝酵母等，细胞含硒量在 650~2050 μ g/g之间。未见有关长孢娄徳酵母作为富硒酵母的相关研宄的公开报导。
【发明内容】
[0006] 基于此，本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的富硒长孢娄徳酵母。
[0007] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0008] 一种长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)，其保藏编号为 CCTCC NO :M 2015301。
[0009] 本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法。
[0010] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0011] 长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，包括以下步骤：
[0012] 将长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)接种于所述YEF1D培养基中培 养，体积比百分比5% -10%的接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量分别为 20-30 %，20-30 %，40-60 %，使硒在 YEPD 培养基中终浓度为 10-20 μ g/mL，28-37 °C 振荡培 养24h_48h，得到富硒的长抱娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)。
[0013] 在其中一个实施例中，接种量为10 %，培养时间为36h。
[0014] 在其中一个实施例中，于对数期6h，9h，12h时分3次梯度加硒，添加量分别为 25 %，25 %，50 %，使硒在YEH)培养基中终浓度为20 μ g/mL。
[0015] 本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的应用。
[0016] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0017] 上述保藏编号为CCTCC NO :M 2015301的长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)或者富硒的长孢娄徳酵母（Lodderomyces elongisporus)在制备水产动物 有机硒饲料添加剂中的应用。
[0018] 在其中一个实施例中，所述水产动物为日本鳗麵。
[0019] 一种水产动物有机硒饲料添加剂，其活性物质含有上述长孢娄徳酵母 (Lodderomyces elongisporus)〇
[0020] 本发明所述的长抱类徳酵母（Lodderomyces elongisporus)已于2015年5月15 日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection,简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学），保藏日期 2015 年 5 月 15 日，保藏编号 CCTCC NO :M 2015301。
[0021] 本发明提供了一种新的长孢娄徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生产有机 硒的可行性，可作为富硒酵母菌株，在有机硒动物饲料添加剂的产品开发中具有良好应用 前景。
【附图说明】
[0022] 图1加硒方式对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
[0023] 图2为接种量对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
[0024] 图3为培养时间对SCLE01富集硒的影响结果示意图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0026] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0027] 实施例1
[0028] 实材料与方法
[0029] I. 1试验材料
[0030] I. I. 1 菌种
[0031] 本发明由发明人利用选择性培养基筛选分离自淡水鱼类肠道的长孢娄徳酵母，对 其进行ITS序列和hsp78基因分析，鉴定结果表明该菌属于长孢娄德酵母，是一株新的长孢 娄德酵母，其分类命名为Lodderomyces elongisporus，编号为SCLE01，并已于2015年5月 15日保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号为CCTCC NO :M 2015301。
[0032] 本发明所述的长孢洛德酵母SCLEOl (L. elongisporus SCLE01，保藏号为CCTCC NO :M 2015301)菌株的形态学特征为：菌落呈乳白色，略粗糙，固体培养基过夜培养后，菌 落小0. 5-lmm，表面比较光滑，边缘整齐，菌落隆起，致密度较高；在液体培养基中静置培养 后，培养液澄清且有沉淀，并有菌蹼出现；显微镜观察显示菌体呈椭圆形。
[0033] 以下保藏号为CCTCC NO :M 2015301的长孢娄徳酵母简称为SCLE01。
[0034] I. 1. 2 培养基
[0035] YEro :酵母粉（YE)1%，蛋白胨（P)2%，葡萄糖（D)2%。固体培养基添加1. 5% 的琼脂粉。
[0036] 麦芽汁培养基（ME):购自环凯微生物有限公司，固体培养基添加1. 5%的琼脂粉。
[0037] I. 1. 3试剂与设备
[0038] 亚硒酸钠、变色酸、盐酸苯肼、高氯酸、氯化钾、盐酸、EDTA_2Na均为分析纯。
[0039] 紫外-可见分光光度计（上海精科，UV 759)，洁净工作台（苏州安泰，SW-CJ)，台 式高速离心机（德国Sigma，3-18K)，恒温鼓风干燥箱（上海齐欣，DHG-9070A)，调温电热板 (常州澳华，DB-3C)，振荡培养箱（哈尔滨东联，HZQ-F160)。
[0040] 1. 2试验方法
[0041] 1.2.1菌种活化
[0042] SCLE01菌株保种菌液2%接种量接种于YEH)液体培养基中，30°C，190rpm，24h，活 化3次后备用。
[0043] 1. 2. 2菌株鉴定
[0044] 将SCLE01菌株纯化后富集，用生理盐水洗去培养基，加入小钢珠，用新芝高通量 组织研磨机进行研磨破碎后利用天根细菌基因组试剂盒进行DNA提取，将提取的DNA进行 ITS序列及hsp78序列扩增，并对扩增产物进行检测，将扩增成功的PCR产物送往生工生物 工程（上海）股份有限公司测序。测序结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据中进行同 源性检索。对测序结果进行分析。
[0045] ITS PCR扩增引物序列如下：
[0046] ITSl :5' 一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（SEQ ID NO. 1)
[0047] ITS4 :5' 一TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'（SEQ ID NO. 2)
[0048] Hsp78PCR扩增引物序列如下：
[0049] LEhsp78-F :5' 一TTGCTCCTCCAAGTGCT- 3,（SEQ ID NO. 3)
[0050] LEhsp78-R :5' 一CAACCCAAACATCTCCC-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0051] 长孢娄德酵母SCLE01经ITSl和ITS4引物扩增、测序、鉴定后获得了 495bp的扩 增产物，序列结果为