一种干细胞大规模培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术中细胞培养领域，特别是指一种干细胞的大规模培养的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞(、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞。
[0003]为了充分运用到干细胞的各项潜能，从而，干细胞的培养成为一个关键，传统的干细胞培养有多种方式，虽然在实验室中都能够较好的达到培养的目的，但当转入到工业运行后，则出现了许多弊端，一个非常大的问题即是，传统的培养方法针对干细胞培养时是贴壁生长的特性，从而培养时，比如滚筒培养，干细胞仅能在滚筒的壁上贴附一层，且这一层还不能太厚，从而极大的制约了干细胞往更大规模的培养，也就限制了干细胞的大量产出。因此，为了提高干细胞的大规模培养，需要对培养的方法进行改进。
[0004]水凝胶3D细胞培养是在传统2D细胞培养的基础上，以水凝胶(hydrogel)或者固体支架的形式增加一个维度，使细胞像在体内一样生长在三维空间里。3D相对于2D细胞培养的优势非常明显:更接近细胞的体内状态；能够提高细胞因子、抗体及其他生物分子等的产量，细胞在3D环境中比在2D环境中生长更健康；在3D细胞培养系统中，干细胞能够有序分化；实验数据更可靠，如基因表达谱、细胞活动等与体内研宄的数据更吻合；能够降低新药研发的成本和周期；可以替代一部分动物实验。而且能够改进细胞培养效率，使干细胞大规模培养成为现实。
[0005]为此，市场上已经出现有纳米纤维支架和多孔支架用于干细胞的3D培养，不过，由于本身纳米纤维支架和多孔支架的材质的原因，一方面成本较高，另一方面，与细胞的相容性等都尚欠缺。
【发明内容】
[0006]本发明提出一种干细胞大规模培养的方法，能够实现干细胞的大规模培养，适于干细胞培养的工业化应用，极具推广价值。
[0007]一种干细胞大规模培养的方法，其特征在于:培养过程中采用了 PNIPAAm (聚N异丙基丙烯酰胺)。
[0008]进一步，所述PNIPAAm在培养过程中作为干细胞生长的载体基质。
[0009]进一步，培养过程中，设置不同的温度梯度，所述PNIPAAm在不同的温度梯度处于不同的相态。
[0010]进一步，所述PNIPAAm至少包括固态和液态两种相态。
[0011]进一步，所述PNIPAAm在37°C时呈牛奶状凝胶固态，室温25°C时是透明水状溶液液态。
[0012]进一步，所述PNIPAAm在固态时作为干细胞生长的支撑基质，液态时用于收集和分呙。
[0013]所述聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)为温度敏感型水凝胶，其能够感知外面环境微小变化以及具有良好的生物相容性，当环境温度高于最低临界温度(LCST)时，其体积会突然剧烈收缩，此时其表面是疏水的，细胞可以黏附生长，当细胞长到一定密度后，降低温度到LCST下，使水凝胶表面亲水，这样细胞就会脱离水凝胶，而不用传统的酶消化，很好的保持了细胞表面的结构与功能，避免了酶消化细胞的操作繁琐，大大减少了工作量。
[0014]聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的大分子链上同时具有亲水性的酰氨基和疏水性的异丙基，水溶液具有最低临界温度(LCST) 32°C，能够在37°C交联成水凝胶，在常温下则为线型的水溶液。利用PNIPAAm在LCST附近发生可逆相转变的特性，可以将PNIPAAm设计成分子开关，结合干细胞培养，用聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的温度敏感性，使细胞在临界温度之上时贴附在材料表面生长，温度在临界温度以下时细胞脱附，改变了传统的酶解脱附细胞的方法。且细胞在水凝胶三维空间里，细胞生长状态良好且状态培养效率升尚O
[0015]进一步，培养过程包括以下步骤:
1、干细胞专用培养液培养干细胞。
[0016]称取一定量的聚N-异丙基丙烯酰胺粉末于15ml离心管中，加入适量的干细胞专用培养液将它溶解。
[0017]2、胰蛋白酶消化:小心吸去旧培养液，用PBS清洗2-3遍，加入适量胰蛋白酶液，37°C消化2-3分钟，显微镜下观察细胞，细胞胞质回缩，不再连接成片，表明细胞消化适度，加入等量的培养液(含10%胎牛血清)终止消化。用枪将已经消化好的细胞吹打成悬液，加入15ml离心管中，离心，弃去上清，加入培养液将细胞吹打均匀，计数。
[0018]3、将适量干细胞加入已配好的含PNIPAAm的干细胞培养液培养，放在37°C，含有5%C02细胞培养箱培养。同时用不含有PNIPAAm培养基培养干细胞作为对照。
[0019]4、24小时后换液。培养皿从培养箱中拿出来放置室温下5-6分钟，至水凝胶由牛奶状态完全变为透明水状后，将细胞转移到15ml离心管中离心，弃去上清，加入干细胞专用培养液将细胞吹打均匀，后接种于培养皿中，放置37°C含5%C02培养箱培养。
[0020]本发明的有益效果为:
1、PNIPAAm生物相容性好，不用酶消化而收获细胞，避免细胞表面蛋白受到损害。
[0021]2、水凝胶三维培养，增加了细胞生长空间，提高了培养效率。
[0022]3、与传统的纳米纤维支架和多孔支架相比，水凝胶支架交联网络中含有大量水分，可以很好地供给细胞养分，同时还可以交联生物活性因子调节细胞的生长和分化，因此水凝胶支架可以更好地模拟细胞生长所需的类组织样物理和空间结构，并且可塑性高、制作工艺相对简单、临床应用方便
4、在37 °〇培养箱内常规培养时，由于低于临界溶解温度，此时培养皿表面的PNIPAAm处于分子收缩的状态，，不影响细胞正常贴壁生长；在25°C左右，由于PNIPAAm分子吸水溶胀，对细胞的吸附力减弱，促使细胞脱落下来。
【具体实施方式】
[0023]下面将结合本发明的具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024]实施例1、人脐带间充质干细胞培养仪器:共聚焦显微镜
主要试剂:聚N-异丙基丙稀酰胺(PNIPAAm)，从sigma公司购买材料:人脐带间充质干细胞
1、间充质干细胞专用培养液培养人脐带间充质干细胞至80%。
[0025]称取一定量的聚N-异丙基丙烯酰胺粉末于15ml离心管中，加入适量的间充质干细胞专用培养液将它溶解。(一般是1ml的培养液加入2g聚N-异丙基丙烯酰胺，不同细胞略微有差异)
人脐带间充质干细胞培养液配制:10%FBS+2%L-Glutamine + DMEM-F12+青霉素浓度为100u/ml+链霉素溶液浓度为100ug/ml
2、胰蛋白酶消化:小心吸去旧培养液，用PBS清洗2-3遍，加入适量胰蛋白酶液(1cm培养皿加入Iml胰蛋白酶)，37°C消化2-3分钟，显微镜下观察细胞，细胞胞质回缩，不再连接成片，表明细胞消化适度，加入等量的培养液(含10%胎牛血清)终止消化。用枪将已经消化好的细胞吹打成悬液，加入15ml离心管中，转速是1000转/分钟，离心4分钟，弃去上清，加入含有PNIPAAm间充质干细胞专用培养液将细胞吹打均匀，计数。
[0026]3、6孔板培养皿中加入3ml已配好的间充质干细胞专用培养液(含PNIPAAm)，细胞数量在1-5X 105/ml，放置37°C含5%C02培养箱培养。同时用不含有PNIPAAm间充质干细胞专用培养液培养间充质干细胞作为对照。
[0027]4、24小时后用预热的培养液换液。6孔板培养皿从培养箱中拿出来放置室温下5-6分钟，至水凝胶由牛奶状态完全变为透明水状后，将细胞转移到15ml离心管中离心，转速是1000转/分钟，离心4分钟，弃去上清，加入Iml间充质干细胞专用培养液将细胞吹打均匀，人脐带间充质干细胞接种于6孔板培养皿中，加入3ml已配好的间充质干细胞专用培养液(含PNIPAAm)，放置37°C含5%C02培养箱培养。
[0028]5、五天后细胞计数观察，发现加了 PNIPAAm的细胞数量是不加PNIPAAm细胞数量的将近2倍。
[0029]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种干细胞大规模培养的方法，其特征在于:培养过程中采用了 PNIPAAm。2.如权利要求1中所述干细胞大规模培养的方法，其特征在于:所述PNIPAAm在培养过程中作为干细胞生长的载体基质。3.如权利要求1或2中所述干细胞大规模培养的方法:其特征在于:培养过程中，设置不同的温度梯度，所述PNIPAAm在不同的温度梯度处于不同的相态。4.如权利要求3中所述干细胞大规模培养的方法，其特征在于:所述PNIPAAm至少包括固态和液态两种相态。5.如权利要求3中所述干细胞大规模培养的方法，其特征在于:所述PNIPAAm在37°C时呈固态，室温25 °C时是液态。6.如权利要求4或5中所述干细胞大规模培养的方法，其特征在于:所述PNIPAAm在固态时作为干细胞生长的支撑基质，液态时用于收集和分离。7.如权利要求6中所述干细胞大规模培养的方法，其特征在于，包括以下步骤: a、干细胞专用培养液培养干细胞； b、胰蛋白酶消化: c、将适量干细胞加入已配好的含PNIPAAm的培养液培养。8.如权利要求6中所述干细胞大规模培养的方法，其特征在于:步骤c中，培养的环境温度为37°C，并在含有5%C02细胞培养箱培养，24小时后换液。
【专利摘要】一种干细胞大规模培养的方法，培养过程中采用了PNIPAAm，聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的大分子链上同时具有亲水性的酰氨基和疏水性的异丙基，水溶液具有最低临界温度(LCST)32℃，能够在37℃交联成水凝胶，在常温下则为线型的水溶液。利用PNIPAAm在LCST附近发生可逆相转变的特性，可以将PNIPAAm设计成分子开关，结合干细胞培养，用聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）的温度敏感性，使细胞在临界温度之上时贴附在材料表面生长，温度在临界温度以下时细胞脱附，改变了传统的酶解脱附细胞的方法，且细胞在水凝胶三维空间里，细胞生长状态良好且状态培养效率升高。
【IPC分类】C12N5/0775, C12N5/0735, C12N5/074
【公开号】CN104894063
【申请号】CN201510274892
【发明人】曾令文, 梅婷, 王斗, 王琳
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日