一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1及其基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，及其编码基因，以及在7-ACA脱 乙酰化中的应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] SGNH家族酯酶（esterase, EC 3. I. I. 1)是一类具有广泛底物特异性的水解酶，包 含脂肪酶、蛋白酶、硫酯酶、芳香酯酶、溶血磷脂酶、碳水化合物酯酶、酰基转移酶活性。该 家族大约在1995年被鉴定，但是其成员仍然很少被定性，它们不同于大部分含有典型的 GxSxG的保守序列的α/β水解酶超家族酯酶，而是含有独特的GDSL的保守序列，是一类 新家族的醋酶。⑶SL家族的醋酶含有5段保守序列区（five consensus sequence blocks I-V)，在5段保守序列区中含有4个较保守的催化位点Ser，Gly，ASn和His，因此又可以分 为SGNH亚家族酯酶。SGNH家族酯酶参与细菌毒力，植物发育和形态发生以及植物防御机制 (Asler IL, et al.，Chembiochem. 2010, 11:2158 - 2167)，本发明的醋酶 EstDl 属于微生物 来源的⑶SL酯酶家族中SGNH亚家族酯酶。
[0003] 脱乙酰化的头孢菌素是工业上合成β-内酰胺类抗生素的重要原料，而脱乙酰化 的头孢菌素通常由头孢菌素 C和7-ACA经化学途径或酶途径脱乙酰化作用得到，酶法因其 反应较温和，产量较高而且伴有较少的副反应而得到重视（Irene Martinez-Martinez, et al.，Analytical Biochemistry. 2007, 369:210 - 217)。因此寻找能够将头抱菌素高效脱乙 酰化的酯酶具有重要的工业价值。
[0004] 然而，天然菌株发酵周期长，产酶量低，纯化困难，生产成本高，难以大量生产，限 制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高SGNH家族酯酶的表 达量，实现其大规模工业化生产。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明提供了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，及其编 码基因，以及含有该基因的重组表达载体、重组菌株，以及EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应 用。本发明从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组中克隆SGNH家族酯酶基因 EstDl，与表达载 体pEASY?-E2连接后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达并对EstDl酶学性质及其对 7-ACA脱乙酰化进行了初步研宄，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重 要意义。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，其氨基酸序列为以下序列之一：
[0008] (1)如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0009] (2) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸 的序列。
[0010] 一种编码上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl，其核苷酸序列为以 下序列之一：
[0011] ⑴如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；
[0012] (2) SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸 的序列；
[0013] (3)在严格条件下，与（1)或（2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
[0014] (4)由于遗传密码子的简并性区别于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0015] 一种重组载体，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl的 完整编码阅读框序列。
[0016] 上述重组载体，载体优选pEASY?-E2。
[0017] 一种重组菌株，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl或 上述重组载体。
[0018] 上述重组菌株的受体菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)。受体菌内含有上述的重组载体，编码碱性热稳定SGNH家 族酯酶EstDl的核苷酸序列被可操作地连接于受体细胞中引起碱性热稳定SGNH家族酯酶 EstDl充分表达的启动子，从而赋予了受体菌产生碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的能力。
[0019] 一种利用上述重组菌株生产碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的方法：培养发酵重 组菌株，诱导SGNH家族酯酶EstDl表达，收集菌体，分离纯化得到SGNH家族酯酶EstDl。
[0020] 上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应用。具体应用时， 按以下方法进行：取100 μ L纯化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有浓度为4. 5g/L7-ACA 的l/15mol/L、pH7. 3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400 yL，25°C反 应，对7-ACA进行降解。
[0021] 本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl可得自嗜热脂环芽孢杆菌 (thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504) 〇 本发明的 SGNH 家族酯酶EstDl总共含有215个氨基酸，理论分子量为25. 31kDa，理论等电点为6. 68。以 乙酸-4-硝基苯酯（PNPC2)为底物：最适温度65°C ;最适pH 8. 5 ;终浓度ImM的金属离子 Hg2+、Mg2+和Cu 2+及化学试剂SDS、TWeen-80、β -巯基乙醇对酶有较强的激活作用，K +、A13+、 Ni2+、EDTA等对酶有抑制作用；在37°C下保温60min，酶活基本保持稳定，在50°C和65°C下 保温60min后，酶活均保持在50%以上；经pH4. 0至pHll. 0的缓冲液在37°C下处理60min 后，均保持50%以上的活性；同时还可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、丁酸-4-硝基苯 酯。
[0022] 本发明通过PCR方法克隆了 SGNH家族酯酶EstDl的编码基因 EstDl，其全长 648bp，起始密码为 ATG，终止密码为 TAG。经BLAST 在 GeneBank (http: //www. Ncbi. Nlm. Nih. gov)数据库进行比对分析，该SGNH家族酯酶的基因 EstDl编码的氨基酸序列与GeneBank 中 Alicyclobacillus hesperidum 来源的 GDSL 家族脂酶（WP_006447773)具有 98 % 序 列一致性（2013-5-29);与 Alicyclobacillus acidocaldarius 来源的 GDSL 家族脂酶 (WP_012811841)具有68%的序列一致性（2013-5-26)，但二者至今均未被鉴定。
[0023] 本发明的SGNH家族醋酶基因来源于嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)，通过在大肠杆菌中进行异源表 达，用IPTG诱导就可以获得大量可溶性蛋白，经Nickel-NTA Agarose纯化即可获得较纯蛋 白。虽然与已申请专利的枯草芽孢杆菌SHS0133来源的头孢菌素乙酰水解酶（光岛健二， 龙本明生，八木兹雄，园山高康，1998,由头孢菌素乙酰水解酶基因编码的酶的制备方法， CN98103932)相比该酶对7-ACA脱乙酰化的活力较低，应用到工业上还需要进一步的发酵 工艺上的优化，如使用大规模培养装置，在适当的培养条件下培养本发明中的重组菌株增 加该酶的产量。但培养周期短、易于获得纯蛋白，并具有优良的酶学性质，而且除头孢菌素 乙酰水解酶外，用于水解7-ACA的其他酶类鲜被报道，因此本发明为工业上生产β -内酰胺 类药物提供了新思路。此外，由于SGNH家族酯酶的成员被定性的很少，所以该家族还没有 被完全了解，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重要意义。
【附图说明】
[0024] 图1 :在大肠杆菌中表达的重组SGNH家族酯酶EstDl的SDS-PAGE分析，其中，M : 低分子量蛋白质Marker ;1 :BL21(DE3)/pEASY?-E2诱导后表达的总蛋白；2 :BL21(DE3)/ EstDl诱导后表达的总蛋白；3 :纯化的重组SGNH家族酯酶EstDl。
[0025] 图2 :重组SGNH家族酯酶EstDl的最适温度示意图。
[0026] 图3 :重组SGNH家族酯酶EstDl的热稳定性示意图。
[0027] 图4 :重组SGNH家族酯酶EstDl的最适pH示意图。
[0028] 图5