6-植酸酶的特异性分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制品分离纯化技术领域，具体地说，涉及一种6-植酸酶的特异性分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]植酸酶广泛存在于植物、动物组织和微生物中。植酸酶分为3类:肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶。目前来源于植物的植酸酶均属于6-植酸酶，最适pH范围在5.0-7.5之间。而3-植酸酶主要由霉菌、酵母和细菌产生，最适PH范围在2.5-5.5之间，适合在单胃畜禽酸性的胃中起作用。因此，从应用的角度出发，饲用植酸酶均为最适PH值为酸性、酶含量较高的微生物来源的3-植酸酶。
[0003]作为有益于动物营养和改善人类生存环境的第二代转基因植物产品，转植酸酶基因的作物可使植物性饲料中磷的利用率大大提高，动物粪便中磷的排出量减少，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便造成的环境污染，还可降低植酸磷的抗营养作用，对提高畜牧生产效益及降低其对环境的磷污染有重要意义。
[0004]目前转植酸酶基因产物主要是来源于微生物(真菌和大多数细菌)的3-植酸酶，而在宿主植物籽实中天然存在的多为6-植酸酶。植物籽实自身6-植酸酶的存在，将直接干扰和影响外源3-植酸酶的活性检测。如何分离纯化植物自身6-植酸酶，将成为转植酸酶基因作物外源3-植酸酶产物活性检测的关键。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种6-植酸酶的特异性分离纯化方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种6-植酸酶的特异性分离纯化方法，所述方法先利用高能电子束以肌醇六硫酸钾分子为交联剂对介孔硅基材料加以改性；再利用改性后的介孔硅基材料特异性吸附样品中的6-植酸酶，形成6-植酸酶与肌醇六硫酸钾分子结合的表面快速反应体系；经植酸钠溶液洗脱后，样品中的6-植酸酶得以分离和纯化。
[0007]进一步地，所述高能电子束束流为0.5mA,电子束能量为5MeV，辐照剂量为lOkGy。
[0008]其中，所述介孔娃基材料为SBA-15, 二维六角相,孔径7_8nm,平均粒径60nm。
[0009]进一步地，所述分离纯化方法具体为:首先用高能电子束辐照活化介孔硅基材料SBA-1515min，然后加入交联剂肌醇六硫酸钾分子后继续辐照30min，完成全部改性交联过程；辐照时，为避免电子束能量过大，工作环境温度控制在4°C;随后将含有植酸酶的样品与改性的介孔硅基材料在25°C条件下温育lh，以10.0mM植酸钠溶液(+2mM氯化钙+2mM氯化镁)洗脱分离，即得到纯化的6-植酸酶。
[0010]本发明的有益效果在于:
[0011]本发明通过高能电子束辐照以肌醇六硫酸钾分子为交联剂对介孔硅基材料加以改性，达到特异性吸附6-植酸酶的功效。同时，此特异性吸附能够竞争性地洗脱解离，从而获得纯度较高的6-植酸酶活性。本发明通过特异性分离纯化去除宿主植物籽实中天然存在的6-植酸酶，亦使得外源3-植酸酶的活性测定更为精确。适用于特定环境样品如土壤、水体和转基因作物籽实根中6-植酸酶样品测定。
【附图说明】
[0012]图1为高能电子束发生器示意图；
[0013]图2为用于改性的介孔娃基材料SBA-15的扫描电镜图；
[0014]图3为交联剂肌醇六硫酸钾的分子结构式；
[0015]图4为介孔硅基材料SBA-15的改性示意图。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0017]实施例1
[0018]采用JSM-35CF型电镜自行搭建的高能电子发生器(图1)，功率10kW，产生电子束流0.5mA,电子束能量为5MeV，辐照剂量为lOkGy。改性的介孔硅基材料为SBA-15，二维六角相，孔径为7-8nm，平均粒径60nm(图2)。改性交联剂肌醇六硫酸钾分子为植酸酶底物植酸分子的结构类似物，对6-植酸酶有高亲合力(图3)。
[0019]福照时首先用高能电子束福照活化介孔娃基材料(SBA-15,5g) 15min,待加入交联剂肌醇六硫酸钾分子(Ig)后继续辐照30min，完成全部改性交联过程。辐照时为避免电子束能量过大，工作环境温度控制在4°C。具体流程框架如图4。改性后的介孔硅基材料通过肌醇六硫酸钾分子形成6-植酸酶结合的表面快速反应体系，能特异性吸附6-植酸酶。
[0020]实施例2
[0021]称取lmg6_植酸酶纯品，加去离子水配制成溶液。取改性介孔硅基材料lg，加入配制好的6-植酸酶溶液(浓度lmg/L) 100ml，于25°C条件下轻微振荡温育lh，振荡速度60转/分。经离心(3000转/分，25°C )去除上清，用0.1M磷酸缓冲液清洗沉淀3次后，加入10.0mM植酸钠溶液(+2mM氯化钙+2mM氯化镁)洗脱，收集洗脱液经冷冻干燥后即获得6-植酸酶纯品，回收率达86.5%。
[0022]实施例3
[0023]取转植酸酶玉米籽粒20粒(均重0.28g)，用液氮研磨粉碎后，加入1ml0.1M磷酸缓冲液搅拌均匀。离心后收集上清，于37°C、pH5.0条件下用钥蓝法测定上清中总的酶活力。取5ml上清液置改性介孔硅基材料(Ig)中，于25°C条件下轻微振荡温育lh，振荡速度60转/分。经离心(3000转/分，25°C)后收集上清于37°C、pH5.0条件下用钥蓝法测定上清中剩余的3-植酸酶活力，同时用0.1M磷酸缓冲液清洗沉淀3次后，加入10.0mM植酸钠溶液(+2mM氯化钙+2mM氯化镁)洗脱，收集洗脱液经冷冻干燥后获得6-植酸酶样品。经钥蓝法测定(37°C、pH5.0)后，玉米籽粒中平均98.7%的酶活力为3-植酸酶，而平均1.3%的酶活力为6-植酸酶。
[0024]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种6-植酸酶的特异性分离纯化方法，其特征在于，所述方法先利用高能电子束以肌醇六硫酸钾分子为交联剂对介孔硅基材料加以改性；再利用改性后的介孔硅基材料特异性吸附样品中的6-植酸酶，形成6-植酸酶与肌醇六硫酸钾分子结合的表面快速反应体系；经植酸钠溶液洗脱后，样品中的6-植酸酶得以分离和纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高能电子束束流为0.5mA,电子束能量为5MeV，辐照剂量为lOkGy。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述介孔硅基材料为SBA-15，二维六角相，孔径7_8nm,平均粒径60nm。4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体为，首先用高能电子束辐照活化介孔硅基材料SBA-1515min，然后加入交联剂肌醇六硫酸钾分子后继续辐照30min，完成全部改性交联过程；辐照时工作环境温度控制在4°C ;随后将含有植酸酶的样品与改性的介孔硅基材料在25°C条件下温育lh，以10.0mM植酸钠溶液洗脱分离，即得到纯化的6-植酸酶。
【专利摘要】本发明提供了一种6-植酸酶的特异性分离纯化方法，所述方法先利用高能电子束以肌醇六硫酸钾分子为交联剂对介孔硅基材料加以改性；再利用改性后的介孔硅基材料特异性吸附样品中的6-植酸酶，形成6-植酸酶与肌醇六硫酸钾分子结合的表面快速反应体系；经植酸钠溶液洗脱后，样品中的6-植酸酶得以分离和纯化。本发明通过特异性分离纯化去除宿主植物籽实中天然存在的6-植酸酶，亦使得外源3-植酸酶的活性测定更为精确。适用于特定环境样品如土壤、水体和转基因作物籽实根中6-植酸酶样品测定。
【IPC分类】C12N9/16
【公开号】CN104894082
【申请号】CN201410081290
【发明人】关潇, 李俊生, 潘卫东, 王敏, 刘茂华
【申请人】中国环境科学研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日