一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备 耐热阿魏酸酯酶的方法。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植 物中的一种酚酸，具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸， 必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体 阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的 强度，但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。
[0003] 阿魏酸醋酶（EC 3. I. 1. 73，feruloyl esterase)又称肉桂酸醋酶或肉桂酰醋酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖 酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的 应用潜能。
[0004] 自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且 它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以 及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发 酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活 化、种子液培养、三角瓶发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，所得到的 阿魏酸酯酶耐热性好、PH适用范围宽、酶活产量高。
[0006] 所述的地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)DBM12,已于2014年1月2日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC (地址为：中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No. 8672。
[0007] 所述深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1，一级种子的制备：首先将液体种子培养基在三角瓶中装液30mL-50mL，调 节pH至7. 0,经121°C灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种菌株，于 40-45°C的摇床上培养18-24h，得到一级种子液；
[0009] 步骤2,二级种子的制备：按照6-10v/v %的接种量将培养好的一级种子液接种到 二级种子培养基中，32-37°C培养18-24h，得到二级种子液；
[0010] 步骤3,自动发酵罐发酵工艺：将发酵培养基装入发酵罐中，121°C下灭菌25min， 将步骤2所得二级种子液倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压0. 05Mpa，发酵开始到发 酵24h，发酵温度控制在40-45°C，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培养基初始 pH7. 0。发酵24-48h，发酵温度提高到45-50°C，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维持150r/ min，发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL，发酵至60h时，向发酵液中添加营养液 200mL，发酵48h-72h，发酵温度降为35-40°C，通风量降至3L/mm，发酵至72h，发酵罐放出一 半体积发酵液，然后添加补料培养基和发酵促进剂，35-40°C条件下继续发酵36h后终止发 酵；
[0011] 步骤4,酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4°C、8000r/min、离心20min，所得 上清进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt% 麦芽糊精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂。
[0012] 作为上述发明的进一步改进，步骤1中一级种子培养基配方为：牛肉膏0. 4g、蛋白 胨 0· 8g、酵母粉 lg、NaCl 0· 5g、KH2P04 0· lg、MgS04 ·7Η20 0· 04、蒸馏水 100mL、pH7. 0,121°C 灭菌20min。
[0013] 作为上述发明的进一步改进，步骤2中二级种子培养基配方为：豆饼粉lg，玉米粉 2g，葡萄糖 2. 5g，蛋白胨 lg，硫酸铵 0· 2g，MgSO4 · 7H20 0· 015g，KH2PO4 0· 008g，定容 100ml， pH 7· 0-7. 4,121°C 灭菌 20min。
[0014] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中发酵培养基配方为：豆饼粉10g，玉米粉 20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，（NH 4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素10mL，泡 敌 O.OOlg，定容至 lOOOmL，调节 pH7.0-7.5，121°C灭菌 15min ;其中，微量元素：CaCl2 2g/ L，MnSO4 · 4H20 0· lg/L，FeSO4 · 7H20 0· 6g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 5g/L，CoCl2 · 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5/L。
[0015] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中补料培养基配方为：大豆秸杆粉10g、麸皮 粉20g、玉米皮粉10g、豆腐澄20g，定容至1000mL，121°C灭菌15min。
[0016] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中发酵促进剂配方为：Tween 8010g，阿魏酸 乙醋0. 8g，去离子水100mL，121°C灭菌15min。
[0017] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中营养液配方：尿素20g、鹿糖50g、玉米衆 100mL、胡萝卜衆 500mL、土?浸出液 500mL，121°C灭菌 15min。
[0018] 本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明的发酵方法不仅发酵液后 续处理简便、生产成本低廉，而且发酵获得的地衣芽孢杆菌活力在218U/mL以上，与国内外 其他发酵罐规模的阿魏酸酯酶生产方法相比，阿魏酸酯酶总产量和酶活力都达到了较高的 水平，具有极好的工业化应用前景；第二，本发明得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适 用范围广，酶制剂在37°C温度下，保存100d，酶活保存在80%以上，阿魏酸酯酶适合在高 温下酶解，在35°C~65°C之间降解酶活较高，相对酶活都在80%以上，酶的最适pH范围在 5. 0-8. 0之间，酶活都在90%以上；第三，本发明所采用的液体发酵工艺简单，环保无毒，原 材料使用豆饼粉、玉米粉、大豆秸杆分、麸皮粉等农副产物，成本低廉，整个发酵过程可控， 不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产；第四，本发明的阿魏酸酯酶 固体酶制剂制备工艺简单，酶活高，酶活力可达378U/g，总回收率达到了 81. 5%。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
[0020] 图2为实施例3中室温条件下湿度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
[0021] 图3为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响；
[0022] 图4为实施例3中pH对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1
[0024] 地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0025] 步骤1，土样采集及处理
[0026] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0027] 取5-10g 土样放入装有20_40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0028] 步骤2,富集培养
[0029] 取l_2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0030] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0031] 富集培养基二：NH4N03 (λ 5g，尿素 (λ lg，KH2PO4 (λ lg，NaCl (λ lg，阿魏酸乙酯 lg， 去离子水100mL，调节pH3. 0。
[0032] 微量元素：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 · 6H20 0· 8g，ZnSO4 · 7H20 0· 7g，CuCl2 · 2H20 0· 3g，H3BO3 0· 3g，（NH4)6Mo7O2 · 4H20 0. 25g，去离子水 1000mL。
[0033] 步骤3,初筛
[0034] 对第二次富集的培养液无