一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农林生物质原料资源化利用和生物技术领域，涉及一种经济高效水解 农林生物质原料制备纤维素糖的方法。 技术背景
[0002] 尽管生物炼制已经成为近年来的研宄热点，但真正的生物质经济时代尚未到来， 利用木质纤维素生产生物能源和生物基产品仍旧面临着许多瓶颈问题，其中基质水解产糖 问题尤为突出。农业废弃物（玉米秸杆、水稻和小麦等）、速生作物（柳枝稷和速生杨等） 和林木（云杉和松树）等生物质具有预处理选择性，导致同种属原料经不同预处理后在组 成和结构上存在显著差异性，而不同种属生物质原料经不同方法预处理后的差异性更大， 这就大大增加了后续酶解的难度。然而，当前商业纤维素酶主要由好氧的纤维素降解真菌 (Trichoderma reesei和Humicola insolens)生产后通过发酵酸预处理玉米稻杆制成，它 们在酶活性和组成方面极其相似，不能满足生物炼制中不同来源木质纤维素原料的需要， 且生产成本较高。
[0003] 尽管杰能科和诺维信两家公司近年几乎同时宣布已能把纤维素乙醇生产的纤维 素酶成本从原每桶5. 4美元降到0. 2美元左右，但许多报道认为酶成本仍然较高，必须继续 降低成本至每桶〇. 03~0. 05美元。由于，⑴不同种属和不同方法预处理木质纤维素的基 质差异性较大，目前来源相同和组成相似的商业纤维素酶制剂不能满足基质特异性需求； ⑵不同来源纤维素酶中的单酶种类及各组分间协同能力存在差异；⑶木质纤维素水解的关 键性酶组分/活性蛋白在总蛋白中含量偏低，比活力不高，这些原因造成了木质纤维素酶 解广糖成本较昂贵。
[0004] 在纤维素酶中添加一些辅助酶和添加剂能够部分解决上述所提出的问题，其原因 是，一些辅助酶能够提高纤维素酶之间的协同作用，更好的水解某一特定的木质纤维素原 料；一些添加剂能够提高原料的可及性、减少木质素的无效吸附以及提高酶的稳定性，达到 提高纤维素酶利用率的效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种经济高效水解农林生物质原料制备纤维素糖的方法。 通过在自产纤维素酶添加辅助酶和添加剂，对甘油有机溶剂预处理的麦草进行酶解，所用 的酶载量低，获得了高的麦草酶解率，为农林生物质原料的高效合理利用奠定了基础。
[0006] 本发明涉及的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法，包括 以下步骤：
[0007] 1、农林生物质原料粉碎：麦草经自然晒干后，切成长度1~5cm的小片段，60~ 80 °C烘干备用。
[0008] 2、原料甘油有机溶剂预处理：原料浓度为5%~15%，初始甘油水溶液浓度为 30~100%，蒸煮温度130~240°C维持1~4h。然后用50%的甘油水溶液洗涤两次，自来 水洗两次，获得的基质烘干测得含水量，用于酶解实验。
[0009] 3、纤维素酶的制备：从里氏木霉试管斜面上挑取一定量的孢子接种于种子培养基 中200~240印111、28~32°0培养24~3011。种子液按照8%~12%的比例接种至发酵培 养基中，220~240rpm、30°C发酵7~9天，所得发酵液经离心后冷冻储存作为实验用的纤 维素酶，并测得其滤纸酶活，CMC酶活，β -葡萄糖苷酶活和木聚糖酶活。
[0010] 种子培养基：土豆20g，葡萄糖20g，去离子水1000mL。
[0011] 发酵培养基为：微晶纤维素5~20g，花生饼粉1~5g，氯化铜0. 05~0. 3g，海 藻糖0· 001~0· 5g，L-抗坏血酸0· 01~0· 5g，PEG10, 0000. 5~5g，480mL柠檬酸缓冲液， 500mL微量元素液，20mL痕量元素液。
[0012] 所述的柠檬酸缓冲液（0· 1M) !Na2HPO4 · 2H20 17. 80g/L，柠檬酸 21. 01g/L。
[0013] 所述的微量元素盐溶液：（NH4)2SO4 2. 8g/L，KH2PCM 4. Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L， CaCl2 · 2H20 0· 8g/L。
[0014] 所述的痕量元素：FeS04 · 7H20 250mg/L，MnS04 · H20 85mg/L，ZnSO4 · 7H20 70mg/ L，CoCl2 · 2H20 100mg/L，浓硫酸调到pH为2,过滤除菌。
[0015] 所制得的纤维素酶酶液各种酶活分别为：FPA酶活0. 6~0. 8U/mL，CMC酶活10~ 25U/mL，β -葡萄糖苷酶活0. 6~I. 0U/mL，木聚糖酶酶活40~60U/mL。
[0016] 4、酶解产糖：在2~15%基质浓度中添加纤维素酶2~30FPU/g基质，β-葡萄糖 苷酶5~10U/g基质，木聚糖酶100~120U/g基质，溶菌酶50~100U/g基质，阳离子聚丙 稀酰胺1~l〇mg/g基质，茶阜素1~10mg/g基质，混合后在40~50°C、100~160rpm条 件下酶解48~96h。
[0017] 5、酶解率的测定：分别在预处理麦草酶解了 6h、12h、24h和48h时，取部分酶解液 稀释到合适倍数后用DNS法测定其中的还原糖浓度，并由此推算出酶解率。
[0018] 本发明的优点在于：
[0019] 1)基质处理所用的甘油有机溶剂预处理方法，去除了大部分木质素，纤维素保留 率尚，有利于尚效酶解。
[0020] 2)纤维素酶生产工艺简单，成本低。
[0021] 3)酶解时所用的酶载量小，酶解效率高。
【具体实施方式】
[0022] 以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。
[0023] 实施例1
[0024] 1、甘油有机溶剂预处理麦草的制备：称取IOg烘干的麦草于500mL的三角烧瓶 中，加入147g工业甘油和53g去离子水（甘油浓度70% )。加热套上200rpm搅拌，加热到 220°C时加上冷凝管，维持3h。到达时间后，撤去加热套待温度降至120°C左右后加入150mL 沸水，150rpm搅拌10min，500mL煮沸的50%的甘油水溶液抽滤两次，然后500mL沸水抽滤 两次。
[0025] 2、纤维素酶的制备：从里氏木霉Rut C-30突变株的试管斜面上挑取一定量的孢 子接种于种子培养基中220rpm、30°C培养24h。种子液按照10%的比例接种至发酵培养基 中，220rpm、3(TC发酵7天，所得发酵液经离心后冷冻储存作为实验用的纤维素酶。
[0026] 种子培养基：土豆20g，葡萄糖20g，去离