消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮 细胞的分离培养方法。
【背景技术】
[0002] 脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，原来是由羊膜包卷着卵黄囊和尿膜的柄状伸 长部而形成的。脐带中动静脉是通过尿膜的血管形成，卵黄囊的血管即形成脐肠系膜动脉 及脐肠系膜静脉。当卵黄囊及其血管退化，脐动脉和脐静脉就发达起来，在这些间隙中可以 看到疏松的胶状的间充质。脐带是母体和胎儿的血液间进行〇) 2和O2、代谢废物和营养物 质交换的地方。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将〇 2和营养物质从胎盘运送 给胎儿，最后由子宫静脉将来自胎儿的代谢废物运走。
[0003] 而某种激素和抗体等亦通过脐带从母体移交给胎儿，但运行机制尚未清楚。通过 体外培养分离和培养脐带上皮细胞，可对脐带上皮细胞的增殖特性，母婴之间的某些激素 和抗体的运转及机制等进行研宄。同时，分离出人脐带上皮细胞，也可应用于人体烧伤皮肤 的恢复应用，具有深远的医学研宄意义。
[0004] 目前，并无人脐带上皮细胞分离的相关技术方案，参考其他组织的上皮细胞分离 方案，均采用组织块培养法来分离上皮细胞。
[0005] 专利申请号为CN201210113304. X的发明报道了一种山羊乳腺上皮细胞的建系方 法，山羊乳腺上皮细胞的分离与纯化为：
[0006] (一）山羊乳腺上皮细胞的分离
[0007] (1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青 霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组 织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的 DPBS溶液洗涤一遍；
[0008] (2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成Imm3小块，用移液器 吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持Icm 2左右；
[0009] (3)37°C、5% CO2、饱和湿度下倒扣干涸培养6~12h，期间勿翻动；
[0010] ⑷上述⑶倒扣干涸培养结束后，添加2mL乳腺上皮细胞培养液，于37°C、5% CO2、饱和湿度下正置培养；
[0011] (5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4~6mL，自接种组织块 72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8~IOmL ;以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情 况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10% FBS+1% ITS+10ng/mLEGF ；
[0012] (二）山羊乳腺上皮细胞的纯化
[0013] (6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80~90 %汇合时，吸取培养基，DPBS洗涤2遍；
[0014] (7)加入乳腺上皮细胞消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细 胞消化液的成分包括0. 02% EDTA和0. 25% Trypsin ;
[0015] (8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已 有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽；
[0016] (9)迅速再次加入上述消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化；
[0017] (10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终 止培养液终止消化；传代比例始终保持1 : 2 ;所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/ F12+10% FBS ；
[0018] (11)重复（7)~（11)步骤，直至成纤维细胞去除干净。
[0019] 专利申请号为CN201410176073. 6的发明提供了一种前列腺组织分离和建立原代 上皮细胞和/或间质细胞的方法，具体步骤包括：
[0020] 第一步：将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到 离心管中，并离心；
[0021] 第二步：用原代细胞培养液重悬组织并转移到T-25培养瓶中，在37°C培养箱中培 养1~2天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，2~3 天后，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出；
[0022] 第三步：用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含 原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞：或者，在倒置显微 镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将间质细胞和组织块刮掉或将上皮细胞和 组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转 移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞或间质细胞。
[0023] 然而，上述现有的组织上皮细胞的获取方法原代培养时间长，获得细胞总数低，细 胞纯度低掺杂成纤维细胞。因此，建立一种快速、细胞得率高、细胞纯度高的脐带上皮细胞 分离方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0024] 有鉴于此，本发明提供了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。 该方法采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化，消化酶组合物性质温和，对细胞损伤 小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
[0025] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0026] 本发明提供了一种消化酶组合物，包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。
[0027] 在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化， 该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
[0028] 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇
[0029] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。
[0030] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。
[0031] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10
[0032] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为30 : 1 :5〇
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg。
[0034] 在本发明提供的一些实施例中，胶原酶VID的规格为125⑶U/mg。
[0035] 在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg。
[0036] 本发明还提供了该消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用；该消化酶组合 物包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶；作为优选，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 (5~30) :(1~10) :(1~10);在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与 胰酶的质量比为5 :1 :1 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的 质量比为5 :5 :10 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量 比为10 :10 :1 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 30 ：1 ：5〇
[0037] 本发明还提供了一种脐带上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
[0038] 采用消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获得脐带上皮细胞进行细胞培 养；该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶W和胰酶。
[0039] 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。
[0041] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。
[0042] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10 :1〇
[0043] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为30 : 1 :5〇
[0044] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg，配制成浓度为 0. 05%~0. 30%。
[0045] 在本发明提供的一些实施例中，胶原酶VID的规格为125⑶U/mg，配制成浓度为 0· 01%~0· 10%〇
[0046] 在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg，配制成浓度为0. 01 %~ 0· 10%〇
[0047] 在本发明提供的一些实施例中，根据脐带表面外层膜的面积，以mL/cm2计，消化酶 的加入量为：透明质酸酶的加入量为lmL/cm 2,胶原酶VID的加入量为lmL/cm2,胰酶的加入量 为 lmL/cm2。
[0048] 作为优选，细胞培养的培养基为添加 EGF的含10% FBS的DMEM/F12培养基。EGF 能够促进细胞增殖，缩短培养周期。
[0049] 作为优选，EGF的质量百分含量为0· 01~1%。
[0050] 在本发明提供的一些实施例中