尘螨变应原及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种尘螨变应原及其应用。
【背景技术】：
[0002] 在引起过敏性疾病的众多变应原中，尘螨是最主要的变应原。尘螨在过敏性疾病 患者特异性免疫诊断中阳性率约70-80%。由于天然变应原提取液的组分非常复杂，恒定其 组分非常困难，且容易受外源性有毒物质、病原微生物的污染，影响其重复性与安全性。而 重组变应原疫苗具有纯度高、无杂蛋白、易标准化、无外源性毒性物质和病原微生物污染的 优势，临床上已有用于免疫治疗。
[0003] 由于尘螨系医学节肢动物，结构和成分复杂，尽管人们从数百种蛋白中已初步鉴 定出24中过敏原成分，而研宄显示尘螨含有过敏原多达30余种；此外，每种过敏原的氨基 酸序列和核苷酸序列还具有序列多型性（sequence polymorphisms)，比如具有146个氨 基酸残基的Der p2变应原具有8种变体，各变体各自具有独特的氨基酸残基取代（Hales BJ，Hazell LA，Smith W，Thomas WR. Genetic variation of Der p 2allergens ：effects on T cell responses and immunoglobulin E binding. Clin Exp Allergy 2002 ；32 (10)： 1461-7.)，这些变体对于研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用以诊断及治疗尘螨过 敏的试剂具有重要意义。
[0004] Chew, F. T.等人在《Cloning of cathepsin D homolog from Blomia tropicalis》 中公开了一种Blo t热带尘螨（Blomia tropicalis)变应原，该Blo t变应原属于组织蛋 白酶D(cath印sin D，CTSD)的同源物。此外，还未见其他属于CTSD同源物的尘螨变应原 的报道。
【发明内容】
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[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种尘螨变应原及其应用，本发明提供的尘螨变 应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过 敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预 防。
[0006] 第一方面，本发明提供了一种尘螨变应原，包含具有与SEQ ID NO: 1所示氨基酸序 列至少90%同源性的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有免疫交叉反 应性的尘螨变应原。
[0007] 如本发明所述的，术语"免疫交叉反应性"为行业内常规理解，当一种抗体可以与 分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应，称为免疫交叉反应；不 同抗原之间具有免疫交叉反应性。
[0008] 第二方面，本发明提供了一种尘螨变应原，包含至少一个T细胞受体特异性识别 的抗原表位，所述T细胞受体特异性识别的抗原表位为如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列 编码的多肽被T细胞受体特异性识别的抗原表位。
[0009] 在本发明一个实施例中，编码如第一方面或第二方面的所述尘螨变应原的氨基酸 序列与SEQ ID NO: 1-致的序列不低于95%，更进一步优选为不低于98%。
[0010] 在本发明一个优选实施例中，编码如第一方面或第二方面的所述尘螨变应原的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 如本发明所述的，"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"是发明人 首次从粉尘螨匀浆中分离纯化得到的一种新的过敏原蛋白，它属于一类组织蛋白酶D的类 似物；分子量约40KDa ;Der f 34是由378个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不O
[0012] 如本发明所述的，当"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"来源于 粉尘螨时，所述"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"与"尘螨Der f34"可 以互换。
[0013] 第三方面，本发明提供了一种诊断个体对尘螨过敏的组合物，包含如第一方面或 第二方面所述的粉尘螨变应原。
[0014] 在本发明一个实施例中，所述组合物还包括但不限于行业内在诊断个体对尘螨过 敏时采用的其他常规成分，比如稀释剂、免疫佐剂、医药可接受之赋形剂或载体。
[0015] 第四方面，本发明提供了一种诊断个体对尘螨过敏的方法，所述方法包含检测该 个体是否会与第一方面或第二方面所述的粉尘螨变应原产生免疫反应。
[0016] 第五方面，本发明提供了一种治疗或预防个体过敏性疾病的方法，所述方法包含 对所述个体投与第一方面或第二方面所述的粉尘螨变应原。
[0017] 第六方面，本发明提供了一种如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原在制备诊 断、预防、治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0018] 在本发明一个实施例中，所述应用为：如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原 在诊断、预防、治疗患者是否对粉尘螨变应原第34组分的过敏中的应用。
[0019] 第七方面，本发明提供了一种编码如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原的核 苷酸序列。
[0020] 如本发明所述的，不难理解，"编码如第一方面所述的尘螨变应原的核苷酸序列" 应该考虑简并碱基，比如，在如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的DNA编码序列包括SEQ ID N0:2,保护范围还应该保护与SEQ ID N0:2具有碱基简并性质的序列，这些核苷酸序列编码 的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO: 1。
[0021] 在本发明一个实施例中，所述编码如第一方面所述的尘螨变应原的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0022] 第八方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有编码如第一方面或第 二方面所述的尘螨变应原的基因表达盒。
[0023] 在本发明一个实施例中，所述重组载体为粉尘螨变应原Der f34基因编码的重组 表达载体，含有SEQ ID NO: 2所示的粉尘螨变应原Der f34基因序列。
[0024] 在本发明一个优选实施例中，所述重组表达载体，是将SEQ ID NO:2所示的粉尘螨 变应原Der f34基因插入至pET-28a的EcoR I与Xho I酶切位点之间。
[0025] 第九方面，本发明提供了一种制备粉尘螨Der f34变应原的方法，包括将如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得粉 尘螨Der f34变应原。
[0026] 在本发明一个实施例中，以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获 得目的基因；PCR产物克隆入pMD-19T(Simple)载体，经测序鉴定正确后的阳性克隆连接至 原核表达载体PET28a，构建的重组质粒pET28a-Der f34,限制性内切酶EcoR I与Xho I双 酶切和测序鉴定后，再转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，培养，破碎后，对蛋白质进行分离纯化。
[0027] 第十方面，本发明提供了一种检测或制备粉尘螨Der f34变应原的编码基因或粉 尘螨Der f34变应原编码基因的变体的方法，包括以下步骤：1)提取粉尘螨总RNA，mRNA纯 化以及反转录得cDNA ;2)设计引物，以cDNA为模板，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述 粉尘螨Der f34变应原的编码基因或粉尘螨Der f34变应原编码基因的变体；其中，所述引 物包括如SEQ ID NO: 3所示上游引物和如SEQ ID NO:4所示下游引物。
[0028] 在本发明一个实施例中，所述粉尘螨Der f34变应原的编码基因如SEQ ID NO: 2 所示。
[0029] 基因测序结果表明尘螨过敏原Der f 34的编码基因由1143个氨基酸组成，该基 因的5'端至3'端的序列SEQ ID NO:2所示。
[0030] 第十一方面，本发明提供了一种如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原、如第 八方面所述的重组载体、如第九方面或如第十方面所述的方法在制备诊断、预防、治疗尘螨 变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0031] 优选地，在制备诊断、预防、治疗粉尘螨变应原（优选为第34组分引起的）过敏性 疾病的试剂中的应用。
[0032] 本发明的效益：
[0033] (1)本发明提供的粉尘螨变应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病 的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组 分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预防；
[0034] (2)本发明通过基因克隆、蛋白质表达制备得到粉尘螨变应原重组蛋白，蛋白纯度 高、特异性较好、产量丰富；
[0035] (3)本发明提供的本发明粉尘螨变应原用于制备诊断、预防或治疗尘螨变应原引 起的过敏性疾病的试剂具有特异性高、成本低的特点；特别地，可高效用于诊断患者是否对 粉尘螨变应原第34组分的过敏。
【附图说明】：
[0036] 图1是本发明实施例提供的尘螨总蛋白SDS-PAGE ;
[0037] 图2是本发明实施例提供的尘螨总蛋白双向电泳结果；
[0038] 图3是本发明实施例提供的粉尘螨蛋白2D免疫印迹的结果；
[0039] 图4包括图4-1和图4-2,图4-1是本发明实施例提供的粉尘螨Der f 34基因 PCR 结果；图4-2是本发明实施例提供的Der f 34电泳图；
[0040] 图5为本发明实施例提供的Der f 31与尘螨过敏病人血清IgE作用的Elisa结 果。
【具体实施方式】：
[0041] 实施例一、尘螨过敏原的鉴定及其氨基酸序列测定
[0042] 一、尘螨的饲养和粉尘螨总蛋白的提取
[0043] 用液氮将粉尘螨研磨成粉末，称取2g样品加入1ml裂解液（9M尿素，4% CHAPS, 60mM DTT, 2% IPG缓冲液），冰上搅拌5min，15000g离心50min后，小心避开上层漂 浮的脂质层，吸取的上清液即为粉尘螨总蛋白。Bradford法定量总蛋白浓度，其余上清用来 蛋白质电泳分析。
[0044] 二、粉尘螨蛋白双向电泳的分离
[0045] 1)第一向等电聚焦电泳（IEF)将已水化的IPG胶条转移到通用型杯上样胶条槽， 在IPG胶条表面上盖适量矿物油，然后分别将两个用双蒸水浸湿过的IEF电极片放在IPG 胶条的两端，将电极压在两个电极片的外缘。架好上样杯，用水化液将样品稀释至终浓度 为lOOug，上样到样