一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属微生物技术领域。具体涉及一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]酶是一类高效、专一的生物催化剂。但酶的高级结构对环境十分敏感，高温、高压、金属离子和极端的PH环境均有可能使酶失活，即使没在最适反应条件下，随着反应时间的延长，也会逐渐失活；并且酶具有难以回收重复利用的缺点，酶的存在还给产物的分离带来一定的困难，因此酶在生物体外的应用严重受到限制。进行酶的固定化可有效解决上述问题。
[0003]现有的固定化方法有物理吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。其中物理吸附法具有酶易脱落、共价结合法具有酶活力回收率低、交联法具有反应条件激烈等缺点。而包埋法制备条件温和，能较好维持酶的构象和活力，还有助于提高酶的稳定性。因而包埋法具有广泛的实用性。为了提高固定化酶的活力和稳定性，在传统包埋载体的基础上，研宄人员不断开发新型的包埋载体，并开始将仿生的思想引入微囊的设计和制备。
[0004]烟酰胺又称尼克酰胺，属B族微生物，是全球14种维生素中第二大维生素。烟酰胺主要存在于动物体内，临床治疗用的多为合成品。广泛应用于医药、食品、饲料、化妆品、化工等行业中。目前烟酰胺生产工艺有化学法和微生物法。化学法工艺较成熟，但需加催化剂、高温、多步反应，且反应后所得的反应液含量不高，组分不纯，不利于提取。生物催化法是采用腈水合酶转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。微生物法生产烟酰胺具有反应条件温和，流程简单，产物产率和纯度高等优点，这些都是化学合成法所不可比拟的。
[0005]文献(OrganicProcess Research & Development, 2009, 13, 584-589)介绍了一种快速高效的固定化腈水合酶的方法，将正硅酸甲酯水解液加入聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)与腈水合酶的混合液中，PAMAM诱导硅酸脱水形成氧化硅纳米颗粒。该方法采用了仿生制备的方法，但制备的固定化酶并非微囊固定化。
[0006]中国专利(CN1424402A)报道了一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，其采用丙酸棒杆菌的腈水合酶将3-氰基吡啶转化成烟酰胺，避免了使化学法催化剂使用量大且反应步骤多的特点，但产酶细胞的制备较为繁琐。
[0007]本发明人通过大量的实验筛选和优化，确定了合适的仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备方法及其在催化合成烟酰胺中的应用，很好的克服了上述问题，制得烟酰胺的纯度和转化率大大提高。
【发明内容】
[0008]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备方法，本发明基于仿生的理念，采用脂质体纳米微囊、硝酸铟水解液、表面活性剂曲通X-100等原料，形成了氧化铟纳米微囊固定化酶。在此包埋过程中，首先实现了酶与复杂包埋环境的分离，避免酶分子与氧化铟间形成共价键，有效的保持了酶活力，脂质体模板的存在实现了对载体形貌控制，同时去除模板实现了对传质的优化。
[0009]为了实现上述目的本发明采用的技术方案如下:
一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的方法，其特征在于:采用的是仿生固定化酶，该酶是由黄色短杆菌腈水合酶被氧化铟纳米壳层包埋而成，具体制备方法:
首先将黄色短杆菌腈水合酶包裹于脂质体纳米微囊中，然后以脂质体纳米微囊为模板在诱导剂偏苯三甲酸的作用下，硝酸铟水解液在脂质体表面脱水形成氧化铟壳层，最后再利用低浓度表面活性剂曲通X-100去除脂质体模板，并用以催化3-氰基吡啶进行水解反应，高选择性转化为烟酰胺。
[0010]一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备，包括以下步骤:
(1)脂质体模板的制备:将大豆磷脂和胆固醇加入到乙醇溶液中，超声形成大豆磷脂和胆固醇浓度分别为10~100 g/L和5~50 g/L的均匀体系；旋转蒸发去除乙醇，在反应器上形成均匀透明的薄膜；再加入0.05-50 g/L的黄色短杆菌腈水合酶溶液使薄膜溶解，经超声分散0.5-4 h，得到终浓度为2~26g/L脂质体溶液；
(2)脂质体微囊的制备:取上述脂质体溶液，在剧烈震荡的情况下缓慢滴加诱导剂偏苯三甲酸，其中偏苯三甲酸浓度为0.05-50 g/L,滴加量为脂质体溶液体积的10~60% ;超声5-15 min后，用乙醇-水溶液多次洗涤，除去游离的偏苯三甲酸和未包埋的游离酶；最后加入脂质体溶液体积的5~20% pH=7的缓冲溶液，形成浓度为5~35 g脂质体/L的乳浊液；
(3)氧化铟壳层的制备:超声下向上述乳浊液中缓慢滴加硝酸铟溶液，滴加完毕后30~80°C下搅拌0.5-2 h，然后用乙醇-水溶液多次洗涤，最后离心分离得包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟微囊；
(4)模板去除:将氧化铟纳米微囊加入脂质体溶液体积2~5倍的质量分数为0.1-2%的曲通X-100溶液中，15-40 min后用乙醇-水溶液多次洗涤，然后离心分离，得除去模板后包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟纳米微囊。
[0011]用本发明方法制得的包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟纳米微囊水解，具体方法为:
将包覆酶的氧化铟纳米微囊和去离子水按照1:10的质量比悬浮于去离子水中，然后加入到含3-氰基吡啶的反应器中，形成3-氰基吡啶质量浓度为20~45%的反应体系，25~45°C的温度下，搅拌进行酶催化反应，经10~35h的反应，直接获得浓度80.5%以上的烟酰胺溶液。
[0012]其中加入的硝酸铟溶液浓度为0.5-80 mg/L，滴加量为脂质体溶液体积的20~75%。
[0013]所述步骤(2)中pH=7的缓冲溶液选自:磷酸氢二钠-柠檬酸、乙酸-乙酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、巴比妥钠-盐酸中的一种。
[0014]本发明提供的一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备及其催化水解性能的优点:
I)借鉴酶在生物体中的存在形式，模仿细胞的多层结构，通过结构、成分和功能仿生制备了具有核壳结构的微囊性