固定化酶载体。与传统的固定化酶载体相比，新型的仿生载体具有活力维持时间长和酶稳定性尚的特点。
[0015]2)本发明所得固定化酶大小分步均匀，粒径在100 nm左右。
[0016]3)黄色短杆菌腈水合酶包埋与微囊内部，受到壳膜的保护，进一步提高固定化酶的重复使用稳定性，回收率高达85%以上。
[0017]氧化铟纳米微囊可实现黄色短杆菌腈水合酶的高效包埋，防止黄色短杆菌腈水合酶的泄露，同时提高了固定化黄色短杆菌腈水合酶在碱性条件下的PH稳定性和重复使用稳定性。黄色短杆菌腈水合酶包埋率达75%，酶活力表现为135%。储存30天后的酶活力仍无明显下降，用于3-氰基吡啶的水解，所得烟酰胺的转化率为98.4%以上。
【具体实施方式】
[0018]一种仿生固定化腈水合酶的制备方法，采用的是仿生固定化酶，该酶是由黄色短杆菌腈水合酶被氧化铟纳米壳层包埋而成，具体制备方法包括以下步骤:
(1)脂质体模板的制备:将15g大豆磷脂和5.5 g胆固醇加入到85 mL乙醇溶液中，搅拌均匀；40°C下旋转蒸发去除乙醇，直至反应器上形成均匀透明的薄膜；再加入10 mL 0.5g/L的黄色短杆菌腈水合酶溶液(以0.1 mol/L、pH=7磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置)使薄膜溶解，经超声分散2 h，得到终浓度为20 g/L脂质体溶液；
(2)脂质体微囊的制备:取上述脂质体溶液，在剧烈震荡的情况下缓慢滴加诱导剂偏苯三甲酸I mL (偏苯三甲酸浓度为1.5 g/L);超声10 min后，用50 mL乙醇-水溶液(体积比1:1)3次洗涤，除去游离的偏苯三甲酸和未包埋的游离酶；最后加入0.1 mol/L、pH=7磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，形成浓度为20 g脂质体/L的乳浊液；
(3)氧化铟壳层的制备:超声下向上述乳浊液中缓慢滴加1.5 mL浓度为5 mg/L的硝酸铟溶液，滴加完毕后50°C下搅拌1.5 h，然后用50 mL乙醇-水溶液(体积比1:1) 3次洗涤，最后离心分离得包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟微囊，扫描电镜分析可知粒径分布为100 nm左右；
(4)模板去除:将氧化铟纳米微囊加入10mL质量分数为0.5%的曲通X-100溶液中，25 min后用50 mL乙醇-水溶液(体积比1:1)3次洗涤。然后离心分离，得除去模板后包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟纳米微囊1.5 go
[0019]用本发明方法制得的包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟纳米微囊催化水解
3-氰基啦啶，具体操作如下:
将包覆酶的氧化铟纳米微囊1.5 g加入15 g去离子水中，然后加入到含10 g 3-氰基吡啶的反应器中，35°C的温度下，搅拌进行酶催化反应，经25 h的反应，直接获得浓度为80.5%的烟酰胺溶液，转化率为98.5%。
【主权项】
1.一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备方法，其特征在于:采用的是仿生固定化酶，该酶是由黄色短杆菌腈水合酶被氧化铟纳米壳层包埋而成，具体制备方法: 首先将黄色短杆菌腈水合酶包裹于脂质体纳米微囊中，然后以脂质体纳米微囊为模板在诱导剂偏苯三甲酸的作用下，硝酸铟水解液在脂质体表面脱水形成氧化铟壳层，最后再利用低浓度表面活性剂曲通X-1OO去除脂质体模板，即可。2.根据权利要求1所述的一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备，其特征是，包括以下步骤: (1)脂质体模板的制备:将大豆磷脂和胆固醇加入到乙醇溶液中，超声形成大豆磷脂和胆固醇浓度分别为10~100 g/L和5~50 g/L的均匀体系；旋转蒸发去除乙醇，在反应器上形成均匀透明的薄膜；再加入0.05-50 g/L的黄色短杆菌腈水合酶悬液使薄膜溶解，经超声分散0.5-4 h，得到终浓度为2~26g/L脂质体溶液； (2)脂质体微囊的制备:取上述脂质体溶液，在剧烈震荡的情况下缓慢滴加诱导剂偏苯三甲酸，其中偏苯三甲酸浓度为0.05-50 g/L,滴加量为脂质体溶液体积的10~60% ;超声5-15 min后，用乙醇-水溶液多次洗涤，除去游离的偏苯三甲酸和未包埋的游离酶；最后加入脂质体溶液体积5~20%的缓冲溶液，缓冲溶液的pH=7，形成浓度为5~35 g脂质体/L的乳浊液； (3)氧化铟壳层的制备:超声下向上述乳浊液中缓慢滴加硝酸铟溶液，滴加量为脂质体溶液体积的20~75%，滴加完毕后30~80 0C下搅拌0.5~2 h，然后用乙醇-水溶液多次洗涤，最后离心分离得包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟微囊； (4)模板去除:将氧化铟纳米微囊加入脂质体溶液体积2~5倍的曲通X-100溶液中，15-40 min后用乙醇-水溶液多次洗涤，然后离心分离，得除去模板后的包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟纳米微囊，所述的曲通X-100溶液的质量分数为0.1~2%。3.根据权利要求2所述的一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备方法，其特征是:步骤(3)加入的硝酸铟溶液浓度为0.5-80 mg/Lo4.根据权利要求2所述的一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备的方法，其特征是:所述步骤(2)中pH=7的缓冲溶液选自磷酸氢二钠-柠檬酸、乙酸-乙酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、巴比妥钠-盐酸中的一种。
【专利摘要】本发明公开了一种包覆黄色短杆菌腈水合酶的氧化铟纳米微囊及制备方法及应用。本发明借鉴酶在生物体中的存在形式，模范细胞的多层结构，通过成分、功能和过程仿生设计，制备了氧化铟纳米微囊，用于包埋黄色短杆菌腈水合酶。借助固定化腈水合酶的高稳定性、高活力性和易回收等特点，来催化3-氰基吡啶高效水解转化为烟酰胺。该仿生固定化酶的制备方法可为微囊性固定化载体的制备提供借鉴意义，为3-氰基吡啶的生物转化提供一条新颖的研究思路。
【IPC分类】C12N11/02
【公开号】CN104894092
【申请号】CN201510241637
【发明人】王红伟, 孔军军, 强金凤, 史玉龙
【申请人】安徽国星生物化学有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月13日