马拉硫磷核酸适体、衍生物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体是一种马拉硫磷核酸适体、衍生物及其应用。
【背景技术】
[0002] 马拉硫磷是高效低毒杀虫、杀螨剂，防治范围广。不仅用于稻、麦、棉，而且因毒性 低、残效短，也用于蔬菜、果树、茶叶，以及仓库的防虫。主要防治稻飞虱、稻叶蝉、棉蚜、棉 红蜘蛛、麦粘虫、豌豆象、大豆食心虫、果树红蜘蛛、蚜虫、粉蚧壳虫、巢蛾、蔬菜黄条跳、菜叶 虫、茶树上的多种蚧类，以及蚊、蝇幼虫和臭虫等。近年来，由于马拉硫磷超标使用而引起的 食品安全事故比较多。
[0003] 目前测定马拉硫磷的主要方法有色谱法、酶抑制法、免疫分析法、化学发光法、生 物传感器法等，但这些方法都存在不足。研宄快速、灵敏、可靠的有机磷农药检测方法迫在 眉睫，开发农药残留的快速检测技术在食品安全、环境保护等方面具有重要意义。
[0004] 核酸适体（Aptamer)是通过 SELEX 技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指数富集的配体系统进化技术），从人工体外合成的随机寡核苷 酸序列库中反复筛选得到的，能与靶分子特异性结合的寡核苷酸。核酸适体作为一种特异 性更好、亲和力更高、品质均一、稳定性好的抗体替代品，在检测分析领域中的应用已经被 广为认可，并具有开发周期短、生产成本低、使用方便的特点。目前，在食品中被严格控制的 诸多有害物质包括生物类毒素、重金属、抗生素等的核酸适体在食品检测领域已经得到了 初步的应用。因此，核酸适体在马拉硫磷这种毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前 景。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术中存在的欠缺之处，本发明要解决的技术问题是提供一种 采用SELEX技术筛选得到的能够与马拉硫磷高特异性和高亲和力结合的核酸适体，并提供 马拉硫磷核酸适体在马拉硫磷检测分析中的应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种马拉硫磷核酸适体，为如下 核苷酸序列的DNA分子：
[0007] TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGTCACGCGGCTGC 或其互补序列。
[0008] 一种马拉硫磷核酸适体衍生物，它具有与马拉硫磷核酸适体相似的功能用途，它 是在马拉硫磷核酸适体的核苷酸序列上标记偶联荧光素、酶、生物素、地高辛、纳米材料、胶 体金、荧光基团、发光物质中的一种或多种得到；或是将马拉硫磷核酸适体的核苷酸序列置 换、缺失或增加碱基得到。
[0009] 一种马拉硫磷核酸适体在马拉硫磷检测分析中的应用，包括以下步骤：
[0010] 1)、将马拉硫磷核酸适体与标靶溶液在一定条件下孵育一段时间；
[0011] 2)、加入分子信标（MB，molecular beacon)并在相同的条件下继续孵育一段时 间；
[0012] 所述分子信标是含有20个碱基的单链DNA，分子信标的5'端和3'端被分别标记 上了荧光基团（FAM)与猝灭基团（DABCYL)，分子信标与马拉硫磷核酸适体杂交的部位从核 酸适体Y末端起第16个碱基至第30个碱基；
[0013] 3)、检测体系的荧光强度，并与空白对照组比较，计算荧光抑制率。
[0014] 所述步骤1)中标靶溶液的预处理步骤为：
[0015] 取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，用含1%甲醇的IXSB缓冲液45°C提取 15min ；
[0016] 称取LOg碎片置于50mL烧杯中，加入IOmL含1%甲醇的IXSB缓冲溶液，放入 45°C的水浴锅中浸提15min。
[0017] 所述步骤1)中马拉硫磷核酸适体的最终浓度为0. 1 μ mol/L，步骤2)中分子信标 的最终浓度为0. 4 μ mol/L，步骤2)中马拉硫磷核酸适体与分子信标的摩尔比为1:4。
[0018] 所述步骤1)和2)的反应均在IXSB缓冲溶液（IXSB缓冲溶液中：Na+浓度为 200mmol/L，K +浓度为 40mmol/L，Mg 2+浓度为 10mmol /T,, Tris 浓度为 50mmol/L，pH 为 8. 0) 中进行。
[0019] 所述步骤1)中马拉硫磷核酸适体与马拉硫磷的作用条件为避光在室温下孵育 20min，步骤2)中的作用条件为避光在室温下孵育60min。
[0020] 所述步骤3)中的检测条件为激发波长为485nm，发射波长为535nm，荧光抑制率计 算公式如下：
[0022] 注：R指荧光抑制率；Fl指含有分子信标和核酸适体时的荧光值；F2指含有分子 信标、核酸适体和马拉硫磷时的焚光值;M指仅含有分子信标时的焚光值。
[0023] 本发明的马拉硫磷核酸适体、衍生物及其应用，采用SELEX技术筛选得到的马拉 硫磷核酸适体具有特异性好、亲和力高、稳定性好、使用方便等优点，可以用于马拉硫磷的 检测分析。
[0024] 该马拉硫磷核酸适体适用于样品中马拉硫磷的快速检测，不仅具有快速、简单、经 济等特点，还具有较高的灵敏度和选择性，对马拉硫磷的检测线性范围为10~200 μmol/ L，检出限为5 μ mol/L。
【附图说明】
[0025] 图1是分子信标的二级结构示意图。
[0026] 图2是检测原理图。
[0027] 图3是马拉硫磷检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不仅限于实施例，在 未脱离本发明宗旨的前提下，所作的任何改进均落在本发明的保护范围之内。
[0029] 请参阅图2, 一种马拉硫磷核酸适体在马拉硫磷检测分析中的应用，包括以下步 骤：
[0030] I)、标靶溶液的预处理步骤为：
[0031] 取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，用含1%甲醇的IXSB缓冲液45°C提取 15min ;称取1.0 g碎片置于50mL烧杯中，加入IOmL含1 %甲醇的I X SB缓冲溶液，放入45°C 的水浴锅中浸提15min。
[0032] 2)、将马拉硫磷核酸适体与标靶溶液在避光室温下孵育20min，反应在I X SB缓冲 溶液（1XSB缓冲溶液中：Na+浓度为200mmol/L，K+浓度为40mmol/L，Mg 2+浓度为IOmmol/ L，Tris浓度为50mmol/L，pH为8. 0)中进行，马拉硫磷核酸适体的最终浓度为0.1 ymol/L。
[0033] 3)、加入分子信标（MB，molecular beacon)(请参阅图1)并在避光室温下孵育 60min，马拉硫磷核酸适体与分子信标的摩尔比为1:4,分子信标的最终浓度为0. 4 μ mol/ L。反应在IXSB缓冲溶液（1XSB缓冲溶液中：Na+浓度为200mmol/L，K+浓度为40mmol/ L，Mg2+浓度为 10mmol/L，Tris 浓度为 50mmol/L，pH 为 8. 0)中进行。
[0034] 分子信标是含有20个碱基的单链DNA，分子信标的5'端和3'端被分别标记上了 荧光基团（FAM)与猝灭基团（DABCYL)，分子信标与马拉硫磷核酸适体杂交的部位从核酸适 体Y末端起第16个碱基至第30个碱基。
[0035] 分子信标与马拉硫磷核酸适体的序列如下表所示：
[0036]
[0037] 4)、检测体系的荧光强度，并与空白对照组比较，计算荧光抑制率。
[0038] 检测条件为激发波长为485nm，发射波长为535nm，荧光抑制率计算公式如下：
[0040] 注：R指荧光抑制率。Fl指含有分子信标和核酸适体时的荧光值。F2指含有分子 信标、核酸适体和马拉硫磷时的焚光值。M指仅含有分子信标时的焚光值。
[0041] 请参阅图3,由此可知，马拉硫磷核酸适体对马拉硫磷的检测线性范围为10~ 200 ymol/L，线性回归方程为y = (λ 17791χ+6· 52771，线性回归系数为0· 99467,检测限为 5 μ mol/L〇
[0042] 以上内容仅仅是对本发明的结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员 对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明 的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种马拉硫磷核酸适体，为如下核苷酸序列的DNA分子： TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGTCACGCGGCTGC 或其互补序列。2. -种马拉硫磷核酸适体衍生物，是在马拉硫磷核酸适体的核苷酸序列上标记偶联荧 光素、酶、生物素、地高辛、纳米材料、胶体金、荧光基团、发光物质中的一种或多种得到； 或者，是将马拉硫磷核酸适体的核苷酸序列置换、缺失或增加碱基得到； 所述马拉硫磷核酸适体为如下核苷酸序列的DNA分子： TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGTCACGCGGCTGC。3. -种如权利要求1所述马拉硫磷核酸适体在马拉硫磷检测分析中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于包括以下步骤： 1) 、将马拉硫磷核酸适体与标靶溶液在一定条件下孵育一段时间； 2) 、加入分子信标（MB，molecular beacon)并在相同的条件下继续孵育一段时间； 所述分子信标是含有20个碱基的单链DNA，分子信标的5'端和3'端被分别标记上了 荧光基团（FAM)与猝灭基团（DABCYL)，分子信标与马拉硫磷核酸适体杂交的部位从核酸适 体Y末端起第16个碱基至第30个碱基； 3) 、检测体系的荧光强度，并与空白对照组比较，计算荧光抑制率。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤1)中标靶溶液的预处理步骤为： 取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，用含1 %甲醇的IXSB缓冲液45°C提取 15min ； 称取1.0 g碎片置于50mL烧杯中，加入IOmL含1 %甲醇的I X SB缓冲溶液，放入45°C 的水浴锅中浸提15min。6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤1)中马拉硫磷核酸适体的最终浓 度为0. lymol/L，步骤2)中分子信标的最终浓度为0.4ymol/L，步骤2)中马拉硫磷核酸 适体与分子信标的摩尔比为1:4。7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤1)和2)的反应均在IXSB缓冲 溶液中进行。8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤1)中马拉硫磷核酸适体与标靶 溶液的作用条件为避光在室温下孵育20min，步骤2)中的作用条件为避光在室温下孵育 60min〇9. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤3)中的检测条件为激发波长为 485nm，发射波长为535nm，荧光抑制率计算公式如下：R指荧光抑制率；Fl指含有分子信标和核酸适体时的荧光值；F2指含有分子信标、核酸 适体和马拉硫磷时的焚光值;M指仅含有分子信标时的焚光值。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体是一种马拉硫磷核酸适体、衍生物及其应用。马拉硫磷核酸适体的核苷酸序列为：TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGT CACGCGGCTGC或其互补序列。将马拉硫磷核酸适体与标靶溶液孵育，接着加入分子信标再次孵育，最后检测体系的荧光强度，并与空白对照组比较，计算荧光抑制率，以实现马拉硫磷的检测分析。本发明采用SELEX技术筛选得到的马拉硫磷核酸适体具有特异性好、亲和力高、稳定性好、使用方便等优点，可以用于马拉硫磷的检测分析。
【IPC分类】G01N21/64, C12N15/115
【公开号】CN104894137
【申请号】CN201510297593
【发明人】王丽, 徐龙峰, 王蓓蓓, 张兴体, 叶勇, 吴从婷, 王丹丹
【申请人】安徽科技学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日