一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术，特别涉及一种利用代谢工程策略，转化丹参SmWRKY70转录 因子提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。
【背景技术】
[0002] 丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge)，是一种多年生的双子叶草本植物，作为一种 传统中药，丹参在临床上主要用于对心脑血管疾病的治疗。丹参中的有效成分主要包括两 大类，一类是脂溶性的丹参酮类化合物，主要包括二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮 IIA等等；还有一类是水溶性的丹酚酸类化合物。大量研宄已经证明，丹参酮具有多种药理 活性，分别是心脑血管保护、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，因此具有巨大的市场 需求。但是，在传统的栽培模式下，丹参生长周期较长、品质严重退化的弊端；而在化学合成 过程中，由于丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污 染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞，其药用活性成分积累量很低而且稳定性很 差，远达不到商业化开发利用的要求。代谢工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟 为提高丹参毛状根中丹参酮成分的含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条新思路。
[0003] 据文献检索分析，WRKY转录因子是植物界中最大的一类转录因子之一，是调控许 多植物过程信号网络必不可少的部分。WRKY转录因子最显著的特征是其DNA结合域中都 至少含有1个WRKY结构域。WRKY蛋白参与植物的许多生理过程，主要包括：生物胁迫、非 生物胁迫、种子的形成、种子的休眠与萌发、植物的衰老和发育。利用代谢工程手段，将丹参 SmWRKY70转录因子转化丹参，获得高产丹参酮的丹参毛状根，为商业化生产丹参酮提供新 型优质药源，目前尚未发现与本发明主题所提及的利用丹参SmWRKY70转录因子提高丹参 毛状根中丹参酮含量的相关报道。因此，本发明在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具 有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的，在于克服现有技术的不足，提供一种提高丹参毛状根中丹参酮含 量的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明从丹参中分离克隆出789bp的 SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了 918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列； 构建了 SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，激光共聚焦显微镜观察显示 SmWRKY70转录因子在细胞核中表达；构建了 SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶 片获得SmWRKY70基因的过表达的转基因丹参毛状根，QRT-PCR分析转基因丹参毛状根中 SmWRKY70以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达，高效液相色谱法（HPLC)测定转 基因丹参毛状根中丹参酮的含量。
[0006] 本发明包括如下具体步骤：
[0007] (1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将 丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所 述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO. 1所示；植物表达载体为经过改造获得 的PCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素 抗性位点。
[0008] (2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参 SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] (3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT-PCR引物，对丹参SmWRKY70 转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析。
[0010] (4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草， 对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析。
[0011] (5)将步骤（1)所获得的SmWRKY70转录因子的植物过表达载体转化发根农杆菌， 获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1。
[0012] (6)将步骤（5)所获得的含SmWRKY70转录因子的植物过表达载体的发根农杆菌菌 株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；所述的经PCR检测的阳 性转基因丹参毛状根是指：在驱动插入基因（SmWRKY70)表达的组成型启动子CaMV35S的内 部及插入基因 SmWRKY70的内部，分别设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下 观察到目的条带的株系即为阳性转基因丹参毛状根株系。
[0013] (7) QRT-PCR分析步骤（6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中 SmWRKY70基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的 株系；QRT-PCT分析转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关 基因的表达，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的转基因丹参毛状根克隆进行总RNA的提 取，并反转录成cDNA，分别设计检测基因及看家基因 Actin的引物，进行QRT-PCR扩增，分析 SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达情况。
[0014] (8)用高效液相色谱法（HPLC)测定步骤（7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中 丹参酮的含量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系；对SmWRKY70基因的表达量 显著提高的转基因丹参毛状根中丹参酮的含量进行高效液相色谱法测定的具体测定方法 如下：将丹参酮粗提物各取20 μ L，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为C-18反相 硅胶柱，流动相为乙腈：水（65 :35,柱温为30°C，流速为lmL/min，检测波长为220nm。
[0015] 本发明应用常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、定量QRT-PCR 分析、丹参酮提取及含量测定等，建立了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。采用遗 传转化丹参SmWRKY70转录因子基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参转基因毛状 根株系，所获得的转基因丹参毛状根中总丹参酮含量显著提高，其中总丹参酮含量最高的 一个克隆为W70-03 (13. 731mg/g)，是对照组（2. 175mg/g)的6. 31倍。本发明提供了一种提 高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质 药源，为商业化大量生产丹参酮和降低药品价格提供了可能，对缓解丹参酮药源的紧缺性 起到积极的促进作用，也为规模化生产丹参酮临床药物的大量需求提供了重要来源。
【附图说明】
[0016] 图 1 为 pCAMBIA2300+: :SmWRKY70 载体构建图。
[0017] 图2为SmWRKY70启动子序列。
[0018] 图3为SmWRKY70在不同组织中的表达情况。
[0019] 图4为SmWRKY70在MJ、SA、YE处理下的表达模式。
[0020] 图5为SmWRKY70的亚细胞定位。
[0021] 图6为丹参的相关基因在SmWRKY70毛状根株系中的表达。
[0022] 图7为HPLC分析SmWRKY70转基因毛状根株系中的丹参酮含量。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请权利要求书所限定的 范围。
[0024] 下列实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆 (Sambrook等）中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建 议的条件。
[0025] 实施例1 :丹参SmWRKY70基因的克隆
[0026] I. 1.丹参总RNA的提取
[0027] 取少量丹参（采用产于山东平邑丹参酮含量较高的丹参品种）幼嫩叶片，用液氮 速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提供的RMpr印Pure Plant Kit使用说明 书提取总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1. 2% ;0. 5 X TBE电泳缓冲液； 150v，15min)检测RNA的完整性。用Nano Drop 2000c超微量分光光度计检测其纯度和浓 度。
[0028] L 2.丹参SmWRKY70基因的克隆
[0029] 以所获的0.5 yg丹参总RNA为起始量，用反转录酶XL (AMV)进行第一链cDNA 的合成（操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书）。根据本实验室所得到的丹参 SmWRKY70基因的转录组序列，分别设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游 引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建表达载体。以所述 的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服 务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果得到了完整的SmWRKY70转录因子基因的 编码框序列（如SEQ ID NO. 1所示）。
[0030] 实施例2 :丹参SmWRKY70启动子的克隆
[0031] 2. 1.丹参基因组DNA的提取
[0032] 采用CTAB法提取丹参嫩叶的基因组DNA，将提取的DNA进行凝胶电泳，初步确定所 提取的DNA完整性，用Nano Drop 2000c超微量分光光度计上检测DNA样品的纯度和浓度。
[0033] 2. 2.丹参SmWRKY70启动子的克隆
[0034] 采用 TaKaRa 公司的 LA PCRTM in vitro Cloning Kit(Code :DRR015)试剂盒 进行SmWRKY70启动子克隆（操作步骤参照TaKaRa公司提供的相关说明书）。将提取的 DNA用限制性内切酶EcoR I、Pst I、Bgl II酶切6个小时，然后用乙醇沉淀回收，连接 试剂盒中对应的接头，4小时后用乙醇沉淀回收。根据SmWRKY70的已知序列，设计引物 SmWRKY70-SPl (SmWRKY70-SPl :5' -GCGGAAGGAGCCTGAGAAGCCTCATCCGAC-3'），以加有接头 的回收产物为模板，用SmWRKY70-SPl+Primer Cl为引物，进行第一轮PCR扩增。然后根据 S