具有改良农业性状的转基因植物的制作方法
【专利说明】具有改良农业性状的转基因植物
[0001] 本申请是分案申请，原申请的申请日为2005年12月19日，申请号为 200580048513. 9 (PCT/US2005/046013)，发明名称为"具有改良农业性状的转基因植物"。
[0002] 相关申请的相互参考
[0003] 本申请要求2004年12月21日美国临时专利申请60/638, 099,35USC§ 119(e)的 优先权，此处纳入本文作为参考。
[0004] 包括序列表
[0005] 在CD-ROM上有序列表和序列表的计算机可读格式（CRF)，都带有创建于2005年 12月18日、大小为63KB (在MS-WINDOWS中测出）并名为"G1543C.ST25.txt"的文本文件， 此处纳入本文作为参考。
[0006] 包括电子序列表
[0007] 在复制的⑶-ROM上附加了一个电子列表，包括了一个名为"hmmer-2. 3. 2"的文件 夹和两个_. HMM文件，纳入本文作为参考。hmmer-2. 3. 2文件夹包含了使用HMMer软件进行 Pfam分析的源代码和其他相关文件。HMM文件包含了 Pfam隐藏Markov模式。电子列表 创建于2005年12月18日。 发明领域
[0008] 此处公开的发明属于植物遗传学和发育生物学。更为具体地说，发明能提供带有 重组DNA的植物细胞以在转基因植物中产生改良性状，这里植物包括了由这些植物而来的 细胞、种子和花粉，以及得到这些细胞、植物、种子和花粉的方法。特别是发明中的重组DNA 表达的是具有同源异型结构域的转录因子。
[0009] 发明背景
[0010] 具有改良性状，如高产、耐受环境压力、抗虫、抗除草剂、改良种子成分等等，的转 基因植物是农业工作者和消费者都渴望获得的。虽然在植物育种上付出的相当努力促使在 获得期望性状的工作上取得重要的成就，但是如果能导入特异基因进植物基因组就能有更 多的机会产生改良和/或稀有性状的植物。仅仅在植物基因组中导入重组DNA不一定总能 获得改良农业性状的转基因植物。从众多转基因事件中筛选各个单独事件的方法是鉴定产 生改良农业性状的转基因事件所必需的。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明使用重组DNA来表达可使转基因植物表现改良农业性状的蛋白。本发明在 构建体中提供重组DNA，该重组DNA包括一个在植物细胞中有功能的启动子，该启动子可操 纵地连接于编码蛋白的DNA上，被编码的蛋白在序列上具有的氨基酸结构域在与Pfam同源 异型框蛋白结构域家族和Pfam HALZ蛋白结构域家族的氨基酸序列比对上超过了 Pfam富 集中止区。对于同源异型框蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在-4,对于HALZ蛋白结构 域家族，Pfam的富集中止区在17。本发明的另一方面特指含有本发明所述DNA的转基因植 物细胞、具有多数这类细胞的转基因植物、能产生后代的转基因种子和从这些植物上得到 的转基因花粉。这些植物细胞从由重组DNA转化的植物细胞培养出来的一定种群的转基因 植物中筛选得到，并表达从这种改良性状种群的转基因植物与不含所述重组DNA的对照组 的比较中筛选出来的蛋白。这里的改良性状是从改良性状组包括改良水份的利用效率、改 良对寒冷的耐受性、提尚广量、提尚的氣利用率、改良种子蛋白质和改良种子油脂。
[0013] 在本发明的另一个方面，植物细胞、植物、种子和花粉还含有能表达蛋白质的DNA， 该蛋白质提供暴露于对所述植物细胞野生型致死水平的除草剂的耐受性。这种耐受性不仅 仅是作为一种优良的性状同时对本发明中的选择步骤也相当有用。在本发明的各个方面 中，这样的除草剂是草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。
[0014] 而本发明的另一些方面则提供了重组DNA的纯合子转基因植物和本发明从玉米、 大豆、棉花、芸苔、苜蓿、小麦或水稻类植物中得到的转基因种子。在阿根廷，在对本发明各 方面实践的其它重要实施方案中，重组DNA转导入来源于玉米株系的植物细胞中，使得这 种细胞可以抵抗MaI de Rio Cuarto病毒和/或玉米锈病（Puccina sorghi)真菌，或者能 维持这种抗性。
[0015] 本发明也提供生产非天然的转基因种子的方法，因为稳定整合的重组DNA能表达 由SEQ ID NO :5-8组中筛选出来的一种蛋白质，使该种子能生长出一批具有改良性状的转 基因植物。更为具体地说，该方法包括了 ： (a)筛选一个种群的具有一种改良性状和重组 DNA的植物，这个种群中的单个植物个体能表现出该性状的程度不低于，基本相当于或大 于，未表达重组DNA的对照组所表现这种性状的程度，（b)从这个种群中选出一个或多个 能表达该性状程度高于对照组的植物个体，（c)确认重组DNA稳定地整合于所述被选植物 中，（d)分析一株被选植物的组织来确定某种蛋白的产量，这种蛋白具有由核酸序列SEQ ID NO :1-4编码的蛋白的功能，以及（e)收集被选植物的种子。对本发明的一个方面，种群中 的植物还含有表达抗除草剂蛋白的DNA，这种蛋白可以使植物耐受对野生型植物细胞致死 剂量的除草剂，当用除草剂，如草甘膦、麦草畏或草铵膦类化合物处理种群时，可以有效地 进行选择。另一个方面，还要鉴定植物的改良性状来对植物进行选择。这此方法对获得玉 米、大豆、棉花、苜蓿、小麦或水稻种子都特别有用。再有，植物还含有表达第二种可以使植 物细胞产生一种或多种改良农业性状的蛋白的DNA。
[0016] 本发明的另一个方面提供了一种生产杂合玉米种子的方法，包括从抗除草剂玉米 植物中获得杂合玉米种子，该玉米植物含有稳定整合的重组DNA，这种重组DNA包含有一 个启动子：（a)该启动子在植物中能发挥功能，（b)可操纵地连接到编码从SEQ ID NO :5-8 组中筛选出的蛋白的DNA上；在这里，子代转基因植物是由所述细胞的一个拷贝再生出来 的，相对于没有所述DNA结构的对照植物能表现出改良性状；这里所述细胞是从使用所述 DNA结构转化的细胞种群中筛选出来，筛选条件是相对于所述对照植物该细胞种群中产生 的子代植物具有改良性状，这里所述改良性状是从因为表达了所述蛋白而产生良好水利用 率、良好耐冻性、高产、良好氮利用率、良好种子蛋白和脂类含量的性状的种群中筛选出来。 这些方法还包括从所述杂合种子来生产玉米植物，在这里一部分由所述杂合玉米种子来源 的植物是对所述重组DNA是纯合子，而一部分所述杂合玉米种子来源的植物则对所述重组 DNA是半合子，以及还有一部分所述杂合玉米种子来源的植物是不含所述重组DNA ;使用除 草剂来选择对所述重组DNA是纯合子和半合子的玉米植物；从除草剂处理后存活的玉米植 物上收集种子，并将其栽培得到次子代玉米植物；重复筛选和收集步骤至少一次以得到近 交系玉米；将近交系玉米与第二种玉米系进行杂交而得到杂合种子。
[0017] 本发明的另一个方面提供了一种选择本发明中的植物包括植物细胞的方法，即应 用免疫反应性抗体来检测在种子和植物组织中是否有重组DNA表达的蛋白生成。另外，本 发明还提供用于反假的碎种子，含有本发明的植物细胞作为原始标记。
[0018] 本发明还有一些方面涉及具有优良水利用率或者氮利用率的转基因植物。比如， 本发明提供了无需灌溉种植玉米、棉花或大豆作物的方法，包括种植含有本发明为改良水 利用率选择出来的植物细胞的种子。可选择的方法包括减少灌溉水，例如在生物玉米作物 时提供多至300毫米地面水。本发明也提供了不加氮肥种植玉米、棉花或大豆作物的方法， 包括种植含有本发明为提高的氮利用率选择出来的植物细胞的种子。
[0019] 发明详述
[0020] 此处所用的"植物细胞"指一种由稳定整合的、非天然的、重组DNA转化的细胞，例 如，由农杆菌介导或用重组DNA包裹的微粒轰击或其它方法造成的转化。本发明中的一个 植物细胞能成为一个原始转化植物细胞，该细胞以微生物型式存在或作为能再生成为分化 组织的子代植物细胞，如长成具有稳定整合、非天然的重组DNA的转基因植物，或由子代转 基因植物产生的种子或花粉。
[0021] 此处所用的"转基因植物"指基因组被稳定整合的重组DNA所改变的植物。一个 转基因植物包括由原始转化植物细胞再生成的植物和从转化植物的后续繁殖或杂交获得 的子代转基因植物。
[0022] 此处所用的"重组DNA"指在细胞外用遗传学计设构建的DNA，包括含有自然存在 的DNA或cDNA或合成DNA。
[0023] 此处所用的"共有序列"指一段在同源蛋白氨基酸序列线性保守区上的人工氨基 酸序列，比如，像同源蛋白氨基酸序列的CLUSTALW线性区所确定的序列。
[0024] 此处所用的"同源体"指在具有相同生物功能的蛋白组群中的一个蛋白，比如属于 同一个Pfam蛋白家族并在本发明的转基因植物中造成相同的改良性状的蛋白。同源体是 由同源基因表达产生。同源基因包括自然存在的等位基因和人造的变体。遗传密码的简并 性使得替换基因的蛋白编码序列中的至少一个碱基时可能不会造成由该基因所产生的多 肽的氨基酸序列改变。因此，一个本发明中有用的多聚核苷酸可能具有由SEQ ID NO :1到 SEQ ID NO :4替换简并遗传密码产生的任何碱基序列。同源体指在与某个鉴定为在植物细 胞中表达时与表现改良性状有关的蛋白进行全长优化比对时，具有至少60%的一致性，较 优选的为70%或者更高，更优选的为至少80%甚至至少90%的一致性的蛋白。同源体包括 具有与其中公开的蛋白质和同源体的共有氨基酸序列有至少90%以上一致性的氨基酸序 列的蛋白。
[0025] 同源体通过比对氨基酸序列进行鉴定，比如手工或利用基于计算机的工具通过著 名的基于同源性的搜索算法进行比对，如著名和常用的BLAST、FASTA和Smith-Waterman。 一个本地的序列比对程序，如BLAST，能用于搜索序列数据库来找到相似的序列，并用简 略期望值（E值）来测量碱基序列的相似性。对于特定生物来说，作为具有最佳E值的蛋 白命中可能不必要是一个ortholog或只是ortholog，在本发明中应用反查（reciprocal query)来过滤对ortholog鉴定有显著E值命中序列。反查法要求对与被查询的蛋白序列相 似的基本生物氨基酸序列数据库搜索显著的命中。当反查的最佳命中就是被查询蛋白本身 或是由物种形成后的复制基因编码的蛋白时，一个命中就是一个可能的ortholog。本发明 的另一个方面包含了有功能的同源蛋白，作为对保守氨基酸的替换，这些同源蛋白与公开 的蛋白相比可能有一个或多个氨基酸的不同，比如以下类型之间的替换：酸性（带负电）氨 基酸如天门冬氨酸和谷氨酸；碱性（带正电）氨基酸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；中性极性 氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺；中性非极性 (疏水性）氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨 酸；具有脂肪族侧链的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族 羟基侧链的氨基酸如丝氨酸和苏氨酸；带有酰胺侧链的氨基酸如天门冬酰胺和谷氨酰胺； 具有芳香族侧链的氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；带有碱性侧连的氨基酸如赖氨酸、 精氨酸和组氨酸；带有硫原子的侧链的氨基酸如半胱氨酸和甲硫氨酸；天然保守氨基酸如 缬氨酸-