一种制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备GGTAl和iGb3S 双基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛 用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官 移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于 人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最 大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的 超急性免疫排斥反应（Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至 数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗 原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免 疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。
[0003] 已有研宄显示异种抗原α -半乳糖基抗原（a-1，3-galactosyle，a-Gal)是动 物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚 乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体 内。a -Gal 主要受 α -1，3 半乳糖基转移酶（a 1，3-galactosyltransferase, a -1，3GT，或 GGTA1)及异红细胞糖苷醋合成酶（isoglobotriosylceramide synthase 或 isogloboside 3synthaSe，iGb3S)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基 错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗a -Gal抗体（占总血清球蛋白的 1-3% )，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排 斥反应及慢性的免疫毒性反应。有研宄证实人血清中的抗a-Gal抗体既与GGTAl催化的 Gal抗原（糖蛋白）反应，也与iGb3S催化的Gal抗原（糖脂肪）反应。
[0004] 国际上早在90年代就有通过构建GGTAl基因敲除小鼠，来研宄a -Gal相关的免 疫学反应，探讨不含Gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle等 报告了 GGTAl基因敲除小鼠模型的成功制作方法，之后开始有报告使用GGTAl基因敲除小 鼠模型研宄其与人所诱导抗体的相似性及其免疫学特征。Chiang TR等报告，GGTAl基因敲 出小鼠免疫后诱导的抗-Gal抗体与a -Gal结合的亲和性和人的抗Gal抗体相似，是能够 诱导Gal抗原阳性异种心脏补片的超急性免疫排斥反应。Chong A等报告，GGTAl基因敲除 小鼠能够诱导自然的抗a-Gal IgM和IgG，并呈现周龄依存性增强；在同种异体或异种补 片移植后可以观察到T-cell依存性的抗a -Gal抗体反应。这些研宄提示GGTAl基因敲除 小鼠模型对Gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。
[0005] a -Gal抗原引起的超急性免疫排斥反应和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入 研宄。许多实验室采用了不同的方法对供器官或细胞进行处理，其中以酶处理法、物理化 学分离法及交联法和基因改造等方法的研宄最广泛。在2000年初研宄者们开始了 GGTAl 基因敲除猪的研宄，甚至GGTAl基因敲除牛的研宄，期望能够直接从GGTAl基因敲除猪或牛 获得没有Gal抗原的组织或器官，以避免动物源性生物材料及异种脏器移植的免疫排斥反 应。Dai Y及Lai L等报道，他们运用核转移技术成功培育出了 GGTAl基因敲除猪（GT/KO pig)。实验研宄显示GGTAl基因敲除猪来源的生物材料能够显著减轻Gal抗原诱导的超急 性排斥反应。
[0006] 国内关于GGTAl基因敲除动物模型的研宄也取得了一定的成果，戴一凡和赖良学 教授是国际上最早报道GGTAl基因敲除杂合子猪的学者。他们回国后在国内先后成功构建 了 GGTAl基因敲除猪的模型，并已经获得了纯合子。然而，关于iGb3S基因敲除动物的研宄 国内未见报道。
[0007] 有研宄发现，GGTAl基因敲除的小鼠或者猪仍然表达a -Gal抗原，仍然能够观察 到后期的免疫排斥反应。另外有研宄已经证实人的组织器官中不表达活性的iGb3,提示 由iGb3S转移酶基因转写的iGb3含半乳糖基脂蛋白可能是动物组织、器官或动物源性材 料移植于人体时造成异种免疫排斥反应的另一种外源性抗原。Milland等的研宄显示在 GGTAl基因敲除动物体内仍然表达低水平但有显著意义的Gal抗原。GGTAl基因敲除小鼠 表达iGb3S mRNA，更重要的是GGTAl基因敲除小鼠来源的抗体与iGb3S合成的脂肪骨架的 Gal α (1，3) Gal抗原反应。这一研宄结果提示iGb3S合成的Gal α (1，3) Gal糖脂肪抗原可 能是造成异体移植慢性免疫排斥反应的主要原因。因此，Milland等认为GGTAl基因敲除 动物虽然避免了急性免疫排斥反应，脂肪连接的Gal抗原是异体移植后期慢性免疫排斥反 应的根源。有学者开始研宄iGb3介导的免疫反应以及iGb3S缺损模型动物的免疫学变化。
[0008] 因此，GGTAl和iGb3S双基因敲除小鼠模型将是深入研宄和评价Gal抗原介导的 免疫反应的有利工具。然而，GGTAl和iGb3S双基因敲除小鼠国内、国际都还没有报道。针 对现有技术的不足和缺陷，特提出本发明。
【发明内容】
[0009] 本发明的首要发明目的在于提出了一种制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺 乳动物的方法。
[0010] 本发明的第二发明目的在于提出该GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的 应用。
[0011] 为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
[0012] 一种制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，包括以下步骤：
[0013] (1)构建打靶载体：分别从基因组DNA中分离GGTAl和iGb3S基因，经长链PCR方 法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建GGTAl打靶载体和iGb3S打靶载体；
[0014] (2)将GGTAl打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中， 移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成 功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得GGTAl的Fl代杂合 子；
[0015] (3)将iGB3S打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中， 移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成 功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得iGB3S的Fl代杂合 子；
[0016] (4)将GGTAl的Fl代杂合子和iGB3S的Fl代杂合子之间交配后获得两条染色体 均被剔出的GGTAl和iGb3S纯合子动物；
[0017] (5)再将GGTAl和iGB3S纯合子动物进行交配，筛选GGTAl和iGb3S同时缺失的双 基因敲除纯合子动物，并建系获得基因敲除动物种群。
[0018] 本发明的第一优选技术方案为：非人哺乳动物为小鼠，进一步优选C57BL小鼠。
[0019] 本发明的第二优选技术方案为：GGTAl基因敲除为敲除GGTAl基因的功能性催化 区第九外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID: 1所示；iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功 能性催化区第五外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:2所示。
[0020] 本发明的第三优选技术方案为：所述GGTAl打靶载体含有5'同源臂、耐药抗生素 基因 NeoR-PA和3'同源臂，用NeoR-PA分别取代第9外显子；所述iGb3S打靶载体含有5' 同源臂、耐药抗生素基因 NeoR-PA和3'同源臂，用NeoR-PA分别取代第5外显子。
[0021] 本发明的第四优选技术方案为：用于GGTAl打靶载体构建的耐药抗生素基因 NeoR-PA 5'端和3'端的同源臂序列取自小鼠第二条染色体上GGTAl基因第9外显子的 5'端和3'端，分别为4. 123kb和7. 343kb ;用于iGb3S打靶载体构建的耐药抗生素基因 NeoR-PA 5'端和3'端的同源臂序列取自小鼠第四条染色体上iGb3S基因第5外显子的5' 端和3端，分别为8. 3kb和9. Ikb。
[0022] 本发明的第五优选技术方案为：
[0023] GGTAl打靶载体的构建步骤为：
[0024] (1)从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第9外显子5'端Cl片段、A片段 和3'端B片段、C2片段，分别连接到pBlunt载体；
[0025] (2)将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到 PL452-GGTA1-A-B，同时，通过Overlap PCR将测序正确的Cl、C2片段融合后连接到 pDTA-Down 载体上；
[0026] (3)将连接正确的 pL452-GGTAl-A-B 用 EcoRV 酶切，pL452-AB 切出 2885bp、2930bp 两条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B 片段重组BAC，鉴定扩增条带正确；
[0027] (4)pDTA-down-GGTAl-C 的线性化处理，g卩 EcoRV 酶切处理 pDTA-Down-GGTAl-C， 回收目的条带，电转已经重组了 NeoR的GGTAl的BAC菌；pDTA-GGTAl-C拯救GGTAl-NeoR BAC (AmpR+KanR);对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经 Stbl3纯化后酶切验证；
[0028] iGb3S打靶载体的构建步骤为：
[0029] (1)从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第5外显子5'端Cl片段、A片段 和3'端B片段、C2片段，分别连接到pBlunt载体；
[0030] (2)将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到PL452载体得到 pL452-iGb3S-A-B，同时，通过Overlap PCR将测序正确的Cl、C2片段融合后连接到 pDTA-Down 载体上；
[0031] (3)将连接正确的 pL452-iGb3S-A-B 用 EcoRV 酶切，pL452-AB 切出 2880bp、2885bp 两条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B 片段重组BAC，鉴定扩增条带正确；
[0032] (4)pDTA-down-iGb3S-C 的线性化处理，即 EcoRV 酶切处理 pDTA-Down-iGb3S-C， 回收目的条带，电转已经重组了 NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoR BAC (AmpR+KanR);对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经 Stbl3纯化后酶切验证。
[0033] 本发明的第六优选技术方案为：步骤（2)包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母 鼠；超排卵；收获受精卵；目的DNA的制备；将目的DNA导入受精卵；受精卵的移植；首建鼠 中目的DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。
[0034] 本发明还涉及来自双基因敲除动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细 胞。
[0035] 本发明还涉及双基因敲除的非人哺乳动物或来自基因敲出动物的精子、卵细胞、 受精卵、胚胎、子代、组织或细胞在生物源性材料、异种器官移植领域研宄和评价及Gal抗 原介导的肿瘤免疫研宄与评价中的应用；所述生物源性材料包括动物源性或取自人体的， 所述的动物源性生物材料不包括灵长类动物；所述的动物源性生物材料的种类包括取自动 物体内的各种组织、脏器及其衍生物，或者由组织或脏器制备的各种材料；所述的灵长类动 物特指古世纪猴、狒狒。所述的应用包括在免疫学研宄、免疫毒理学、异种免疫排斥反应及 其机理的研宄、肿瘤免疫学研宄及安全性评价中的应用；所述的安全性评价包括生物源性 材料、GGTAl基因敲除猪、牛等异种器官移植在临床试验前的安全性评价。
[0036] 打靶载体剔出序列片段是GGTAl第9外显子的全长694bp，其核苷酸序列如SEQ NO ID:1 ：
[0037] 20430G TACATTGAGC ATTACTTAGA AGACTTTCTG
[0038] 20461GAGTCTGCTG ACATGTACTT CATGGTTGGC CATCGGGTCA TATTTTACGT CATGATAGAC
[0039] 20521GACACCTCCC GGATGCCTGT CGTGCACCTG AACCCTCTAC ATTCCTTACA AGTCTTTGAG
[0040] 20581ATCAGGTCTG AGAAGAGGTG GCAGGATATC AGCATGATGC GCATGAAGAC CATTGGGGAG