一种提高fk228产量的发酵培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培养基，具体涉及一种提高抗肿瘤药物FK228产量的发酵培养基。
【背景技术】
[0002]FK228 (罗米地辛)是科学家在研究细菌代谢物时从紫色杆菌(Chromobacteriumv1laceum)的肉汤培养基中分离得到的一种天然的双环缩酚酸肽。FK228在结构上是前体药物，通过二硫键及酯键形成双环结构，其中二硫键是发挥活性的关键基团，其氨基酸序列含有普通L-型缬氨酸、D-型缬氨酸、D-型半胱氨酸以及带有双键的特殊氨基酸(Z) -2-氨基-2- 丁烯酸和含巯基的链状结构单元(3S，4E)-3-羟基-7-巯基-4-庚烯酸，具有通过酰胺键和酯键交替连接的特点。
[0003]FK228作为环形妝类去乙酸化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)，能够抑制非小细胞肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、恶性胶质瘤细胞、食管鳞状细胞癌细胞、白血病细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞及结肠癌细胞的增殖，并诱发细胞凋亡。FK228可以通过上调p21的表达，引起p21依赖的Gl期阻滞，也可以引起p21非依赖的G2/M期阻滞，因此FK228能够从多个方面抑制肿瘤细胞的生长和增殖，FK228通过促进Bmf启动子区内组蛋白的乙酰化修饰，上调Bmf的表达，活化线粒体凋亡信号通路，诱导多种肿瘤细胞凋亡。FK228也可以诱导HSP90的乙酰化修饰，改变其分子构象，促进HSP90的底物蛋白与HSP90分离并降解，由于HSP90的底物蛋白中包括多种抗凋亡蛋白和激酶蛋白如Raf-1，erbB2，AKt及Bcl-Abl等，这些蛋白的降解导致了多种抗凋亡信号通路的灭活，进而促进FK228诱导的细胞凋亡。目前，FK228已经在T细胞淋巴瘤，白血病及一些耐药实体瘤的治疗中进入Ι/Π期临床试验，并取得了显著的疗效。并且，在2009年，FK228通过了 FDA批准用于皮肤T2细胞淋巴瘤的临床治疗。
[0004]目前，FK228的合成有化学合成、固相合成、生物合成等方法。但化学合成、固相合成步骤繁琐、工艺复杂、成本高，不适于推广应用，而现有的生物合成方法产量提高有限，因此，有必要研究开发新的方法，以提高FK228的产量，以期满足实际应用的需求。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对目前的培养基培养色杆菌(Chromobacteriumv1laceum),其FK228的产量不高的现状，而提供一种新的能够提高FK228产量的培养基，其可以大大提闻FK228的发酵单位，提闻生广效率。
[0006]本发明提供的技术方案之一是:一种提高FK228产量的发酵培养基，其由常规的培养色杆菌的发酵培养基中加入吸附树脂所得，所述吸附树脂的加入量为每升发酵培养基中加入10?50克吸附树脂，所述吸附树脂选自XAD1600、XAD16、HP20、SP850和HZ830中的任一种或多种，所述发酵培养基的pH值为5.0?5.5。
[0007]本发明中，所述的常规的培养色杆菌的发酵培养基为本领域常规的用于培养色杆菌以获得相应发酵产物的发酵培养基，如文献“Shigematsu N, Ueda H, Takase S，etal.FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacteriumv1laceum N0.968.1.TAXONOMY, FERMENTAT1N, ISOLAT1N, PHYSICO-CHEMICAL ANDB1LOGICAL PROPERTIES, AND ANTITUMOR ACTIVITY[J].Journal of antib1tics, 1994, 47(301): 301-310”中所使用的培养基。
[0008]本发明中，所述的色杆菌为本领域常规所述，较佳的为紫色色杆菌(Chromobacterium v1laceum),更佳的是紫色色杆菌(Chromobacterium v1laceum)FERMBP-1968。
[0009]本发明中，所述的发酵培养基优选包括质量百分数为I?4%的葡萄糖、2?5%的蛋白胨，0.5 ?2.5% 的 KH2PO4,0.5 ?1.5% 的 Na2HPO4,0.1 ?0.4% 的(NH4) 2S04,0.00 5 ?0.2%的MgSO4.7H20，0.4?1.5%的氨基酸和10?50g/L的吸附树脂，所述氨基酸为半胱氨酸或半胱氨酸与缬氨酸、苏氨酸和精氨酸中的任一种或多种的组合，所述吸附树脂选自XAD-1600, XAD-16、HP20、SP850和HZ830中的任一种或多种，所述发酵培养基的pH值为5.0 ~ 5.5o
[0010]本发明中，所述的发酵培养基更优选包括质量百分数为0.8?1.2%的碳源、1.5?2.5% 的氮源，I ?2% 的 KH2PO4,0.7 ?1.2% 的 Na2HPO4,0.05 ?0.1% 的(NH4)2SO4j0.006 ?0.01%的MgSO4.7H20，0.6?1.2%的氨基酸和20?40g/L的吸附树脂，所述氨基酸为半胱氨酸或半胱氨酸与缬氨酸、苏氨酸和精氨酸中的任一种或多种的组合，所述吸附树脂选自XAD-1600、XAD-16、HP20、SP850和HZ830中的任一种或多种，所述发酵培养基的pH值为5, I ?5, 3o
[0011]本发明中，所述的发酵培养基最优选包括质量百分数为1%的葡萄糖、3%的蛋白胨，1.1% 的 KH2PO4,0.72% 的 Na2HPO4,0.1% 的(NH4)2S04,0.006% 的 MgSO4.7Η20，0.6% 的半胱氨酸和20?40g/L的吸附树脂，所述吸附树脂选自XAD-1600、XAD-16、HP20、SP850和HZ830中的任一种或多种，所述发酵培养基的pH值为5.2。
[0012]本发明所述的发酵培养基的制备方法为常规，只要将各组分以水，较佳地是蒸馏水溶解，再以高温灭菌即可。
[0013]本发明提供的技术方案之二是:一种发酵生产FK228的方法，其包括以前述培养基发酵培养色杆菌生产FK228的步骤。
[0014]本发明中，以前述培养基发酵培养色杆菌生产FK228时，使用常规的方法即可，即将色杆菌接种于前述培养基，然后进行常规发酵即可。
[0015]较佳地，所述的方法包括步骤:将色杆菌种子液按质量比7?15%的接种量接种于如前所述的发酵培养基，然后将发酵瓶在25?35°C、转速180?250rpm的摇床上培养2?4天。
[0016]所述的方法较佳地还包括制备所述种子液的步骤:
[0017](I)将产FK228的色杆菌接种于斜面培养基上进行活化；
[0018](2)将活化得到的菌落接种于种子培养基培养得到种子液。
[0019]其中，制备所述种子液的步骤更优选包括:
[0020](I)将产FK228的色杆菌接种于斜面培养基上进行活化；
[0021](2)将活化得到的菌落接种于种子培养基培养得到种子液；所述种子培养基由0.5?1.5%葡萄糖，0.5?1.5%胰蛋白胨，0.3?0.6%酵母提取物，和0.3?0.6%NaCl组成，所述的百分比为质量百分比，所述种子培养基的pH为7.0?7.2。
[0022]最佳地，所述的方法包括如下步骤:
[0023](I)将产FK228的色杆菌接种于斜面培养基上于30°C培养箱中培养I天进行活化，所述斜面培养基由1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl和2%琼脂组成，所述的百分比为质量百分比，所述斜面培养基的PH为7.0 ;
[0024](2)将活化得到的菌落接种于种子培养基，于30°C摇床培养20小时得到种子液，所述种子培养基由1%葡萄糖，1%胰蛋白胨，0.5%酵母提提物和0.5%NaCl组成，所述的百分比为质量百分比，所述种子培养基的PH为7.0 ;
[0025](3)将(2)所得的种子液接种前述发酵培养基，然后将发酵瓶在25°C、转速200rpm的摇床上培养60小时。
[0026]本发明中，步骤(3)之后还优选包括收获FK228的步骤。所述收获FK228采用一般收获发酵产物的方法，更优选向发酵液中加入I?3倍体积的丙酮萃取，过滤后取上清即得FK228 ;最优选向发酵液中加入2倍体积的丙酮萃取，过滤后取上清即得FK228。
[0027]本发明在实际的工业化生产中，由于所使用的吸附树脂可以进行循环重复利用，为了进一步降低生产成本，可以对所使用的吸附树脂进行回收再利用，在回收的同时，由于吸附树脂中也含有一定量的发酵产物，有必要将吸附树脂中的FK228也一并收获。因此，所述收获FK228的步骤较佳地还包括以丙酮浸泡吸附树脂20?60分钟，过滤后取上清，即得FK228。浸泡吸附树脂时，对丙酮的使用量没有特别要求，只要其能够浸没吸附树脂即可。
[0028]本发明所述的发酵培养基中还可以加入其他能被利用的碳源、氮源和无机盐等成分，只要该些成分与本发明前述培养基中的各组分之间不存在相互拮抗作用即可，这些成分可预先一次性地加入培养基中，实现FK228的高产量化。
[0029]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0030]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0031]本发明的积极进步效果在于:
[0032]相比现有的培养基，本发明的发酵培养基用于培养色杆菌可以大大提高发酵产物FK228的产量，最高可提升100%，从而大大降低了生产成本，具有非常好的工业化应用前景。另外，本发明所使用的吸附树脂均可以进行回收，实现循环利用，从而在提高FK228产量的同时进一步降低了生产成本。
【具体实施方式】
[0033]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0034]下述实施例中，所述的百分比如无特别说明，均指质量百分比。
[0035]下述实施例中，所使用的色杆菌为购自日本国际专利组织保藏机构，保藏编号为FERM BP-1968的紫色色杆菌WB968。
[0036]实施例1
[0037]本实施例所使用的发酵培养基的组成为:葡萄糖1%、蛋白胨4%、磷酸二氢钾1.1%、磷酸氢二钠0.72%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.006%、半胱氨酸0.6%，吸附树脂XAD_16003% (w/V)，用10%的盐酸溶液调整培养基PH至5.2。
[0038]在接种发酵培养基之前，先将冻存的色杆菌于斜面培养基上活化以及于种子培养基中培养得到种子液。所述的斜面培养基的组成为:1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl和2%琼脂，所述的百分比为质量百分比，所述斜面培养基的pH为7.0 ;于121 °C灭菌30分钟，铺制成固体斜面。将菌种接于此斜面上，在30°C培养箱培养I天，将生长良好的斜面菌种接种于种子培养基中。所述的种子培养基的组成为:1%葡萄糖，1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提粉和0.5%NaCl，所述的百分比为质量百分比，所述种子培养基的pH为7.0;种子培养基于121°C灭菌20分钟后冷却备用。接种于种子培养基中后在30°C，转速200rpm的摇床培养20小时后，得到的种子液用于接种发酵培养基。
[0039]种子液按10%的接种量接于发酵培养基，接种发酵培养基后，将发酵瓶在25V、转速200rpm的摇床上培养60小时，发酵结束后向发酵液中加入2倍体积的丙酮萃取，过滤后取上清即得FK228。另外，将吸附树脂XAD-1600回收，以丙酮浸泡回收的吸附树脂，过滤后取上清即得FK228。HPLC测定两部分得到的上清中FK228的含量，其结果为503mg/l。
[0040]对比例I
[0041]按现有技术制备生产FK228的发酵培养基，其已经于文献“FR901228，a novelan