一种产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的单菌落琼脂块筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及产羟脯氨酸菌株的筛选，具体的说是一种以固体培养方式，利用单菌 落琼脂块法和氨基酸显色法筛选产反式-4-羟脯氨酸菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 反式-4-轻脯氨酸（trans-4-Hydroxy-L-ProLine)又名L-轻脯氨酸，是轻脯氨酸 在自然界中最为常见的一种立体异构体，是一种高附加值的小品种氨基酸，最早发现于动 物胶原蛋白中。它广泛应用合成碳青霉烯类抗生素、血管紧张肽转化酶抑制剂、消炎药等， 如厄他培南、美罗培南；作为合成多种聚合物的必不可少的手性原料之一，在化工合成方面 发挥着重要作用；由于反式-4-羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，在食品工业上亦可作 为食品添加剂使用。此外，它还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因 此在美容业方面有着应用领域。反式-4-羟脯氨酸在国内外具有广阔的市场空间，目前，世 界用量500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。因此，筛选高产反式-4-羟脯氨酸 菌株有重大而深远的意义。
[0003] 近年来，国内外对L-羟脯氨酸发酵的研宄很多，主要围绕着菌种基因工程改造、 发酵工艺条件优化、溶剂提取和产量检测等方面进行。无论是通过基因工程技术还是常规 的诱变方法，最终都将涉及到从改造后的菌株中分离高产L-羟脯氨酸菌株的问题。
[0004] L-羟脯氨酸含量测定通常用的方法是比色法、氨基酸自动分析法、气相色谱/质 谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等，这些方法不适合大批量筛选诱变育种后产生的不 定向突变菌株。
[0005] 综上，本发明提供一种以固体培养方式，利用单菌落琼脂块法和氨基酸显色法筛 选高产L-羟脯氨酸菌株的方法。此方法利用打孔琼脂块的大小、厚度一致及生长状态均匀 等条件，使被筛选的菌落处于生长状况和营养条件比较一致的状态。此方法模拟了摇瓶发 酵时各菌株间在相同条件下发酵产羟脯氨酸的情况，显著减少了工作量，通过显色深浅以 及显色圈与菌落直径之比，确定L-羟脯氨酸产量高低，缩短了筛选周期，提高菌种选育效 率，为实现大批量筛选产L-羟脯氨酸菌株奠定基础。
【发明内容】
[0006] 发明解决的技术问题是提供一种方便的筛选产L-羟脯氨酸菌株的单菌落琼脂块 法
[0007] 本发明技术内容如下：
[0008] (1)发酵培养基琼脂平板的制备：培养基成分能够维持菌体生长，以及能促使羟 化酶的表达，完成L-脯氨酸到反式-4-羟脯氨酸的转化，灭菌后，待培养基冷却至适宜温度 时，等量分装至培养皿中。
[0009] (2)标准色板的制备：
[0010] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0011] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0012] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I :1)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0013] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0014] ⑤点加5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0015] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0016] (2)重组大肠杆菌经诱变后，稀释涂布于平板培养基，适宜温度培养至2_左右的 单菌落长出。
[0017] (3)用打孔器将单菌落取出置于滤纸上，使菌落产生的L-羟脯氨酸渗透到滤纸 上，待其干燥。
[0018] (4)点加试剂①，热风吹干，不同氨基酸显示不同颜色；试剂①配制：B引哚醌溶于 乙醇和冰醋酸中。
[0019] (5)点加试剂②，热风吹干，L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色；试剂 ②配制：对二氨基苯甲醛溶于丙酮和浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增 深发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0020] (6)据显色圈深浅与标准色板对比，显色越深，以及显色圈与菌落直径之比越大， L-羟脯氨酸产量越高。
[0021] 本发明的原理：各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可以借此辨认氨 基酸。氨对吲哚醌显色没有妨碍，但其灵敏度不是太高，显色不是太稳定，颜色只有在绝对 干燥的环境中才能保存。在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成深蓝色化合物，羟脯氨酸 与吲哚醌反应形成墨绿色，墨绿色和深蓝色不易区分；再点加试剂②中含有对二氨基苯甲 醛进一步区分，L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色。但在本发明中由于L-脯氨 酸和L-羟脯氨酸的浓度较小，二者与吲哚醌显色会与理论上略微有些差异。
[0022] 测羟脯氨酸含量的方法主要有：比色法、氨基酸自动分析法、气相色谱/质谱法、 高效液相色谱法、毛细管电泳法等。传统的测定羟脯氨酸的方法是比色法，其操作步骤繁 琐，影响因素多，样品需要量大，且特异性、灵敏性差；与比色法相比，氨基酸自动分析法是 一种快速、准确、灵敏度高的测定方法，但其费用高，普通实验难以实现，而且存在需要较多 缓冲液、反应温度高、反应速度慢等局限。20世纪70年代，高效液相色谱技术的发展为提高 测定羟脯氨酸含量的灵敏度提供了新途径，但该方法需要对样品进行一定程度上的衍生， 并且柱后衍生需要附加装置；20世纪80年代发展起来的毛细管电泳与电化学测定相结合 的技术成为氨基酸分析的新的发展趋势，具有进样量少、绝对灵敏度高、分辨率高等特点。 以上检测技术一般需要先发酵培养待筛选羟脯氨酸生产菌株，无法方便快速地用于大批量 的菌种筛选。
[0023] 本发明所述的方法能够通过滤纸上个体菌落显色颜色的深浅，与标准比色板比 较，从而筛选高产L-羟脯氨酸的菌株。本发明适用于大批量筛选诱变育种发生不定向突变 的菌株，有效缩短了筛选周期。下面通过实施例对发明作进一步的说明，其目的是更好的理 解本发明的内容；但不以本实施例对发明造成限制。
【附图说明】：
[0024] 图1不同浓度的L-脯氨酸溶液点加在滤纸上的状况，均不显色，第一个为对照， ι-ll号浓度依次增大。
[0025] 图2不同浓度的L-羟脯氨酸溶液点加在滤纸上的状况，均不显色，第一个为对照， ι-ll号浓度依次增大。
[0026] 图3不同浓度的L-脯氨酸和L-羟脯氨酸混合液（I: 1)点加在滤纸上后的状况， 均不显色，第一个为对照，1-11号浓度依次增大。
[0027] 图4在图1的基础上点加试剂①后的显色情况，即L-脯氨酸与试剂①显蓝色，第 一个为对照，ι-ll号显色逐渐加深。
[0028] 图5在图2的基础上点加试剂①后的显色情况，即试剂①与L-羟脯氨酸不显色。
[0029] 图6在图3的基础上点加试剂①后的显色情况，即试剂①与L-脯氨酸和L-羟脯 氨酸混合液（1:1)显蓝色，颜色随溶液浓度增大依次加深。
[0030] 图7在图4的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②使L-脯氨酸褪色。
[0031] 图8在图5的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②L-羟脯氨酸显玫红色， 颜色随溶液浓度增大依次加深。
[0032] 图9在图6的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②使L-脯氨酸和L-羟脯 氨酸混合液（1:1)显玫红色，颜色随溶液浓度增大依次加深，为标准色板。
[0033] 图10为本发明实例1中高产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他4株菌为高产菌。
[0034] 图11为本发明实例1中低产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他4株菌为低产菌。
[0035] 图12为本发明实例2中高产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他5株菌为高产菌。
[0036] 图13为本发明实例2中低产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他5株菌为低产菌。
[0037] 例 1
[0038] (1)取以下原料配成培养基：甘油20g/l，胰蛋白胨8.81g/l，磷酸氢二钾2g/l， 硫酸铵 5g/l，NaCl 2g/l，Mg2+0.0 2 %，Ca2+O. 2 %，L-脯氨酸 8. 98g/l，Fe2+2mmoL/l，琼脂 1.5%，其余为水，于121°〇灭菌151^11，待培养基冷却至60°〇左右时，加入适量氨苄青霉素， 以IOml/个培养皿分装培养基。
[0039] (2)氨苄青霉素母液制备：准确称取50mg氨苄青霉素，溶解后定容至1ml，得到 5〇g/l氨苄青霉素母液；然后过滤除菌备用。
[0040] (3)试剂①配制：Ig吲噪醌溶于100mL乙醇和IOml冰醋酸；试剂②配制：Ig对二 氨基苯甲醛溶于90ml丙酮和IOml浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深 发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0041] (4)标准色板制备：
[0042] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0043] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0044] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I: I)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0045] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0046] ⑤点加 5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0047] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0048] (5)使用经常压室温等离子体诱变处理的菌株为出发菌株，取诱变后浓度为 ΙΟΛιΓ