一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量pcr引物和探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一种定量检测柑橘半穿刺线 虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 在柑橘根围有多种的植物寄生线虫，但只有少数的几种能对柑橘的产量造成影 响。其中柑橘半穿刺线虫危害最严重的一种线虫，因此，这种线虫也被称为柑橘线虫。柑 橘半穿刺线虫（ira/75·)分布广泛，目前在世界各个主要的柑橘种植 区域都发现该种线虫。刘国坤指出在中国的80%以上的柑橘种植园中都有该种线虫存在。 柑橘半穿刺线虫危害后会引起柑橘的"慢性衰退病"，该种病能造成超过30%以上的产量损 失。
[0003] 柑橘"慢性衰退病"的诊断非常困难，因为该病的症状主要是黄化、萎蔫、植株生长 缓慢、叶片较小和较少、果实较小和产量下降，这些症状与由于缺水或缺乏营养导致的症状 类似。目前，准确的诊断该病的唯一方法就是鉴定土壤中是否存在柑橘半穿刺线虫，以及判 断这种线虫的种群数量是否达到了危害阈值。这就需要进行土壤采样，然后鉴定线虫种类 和测量柑橘半穿刺线虫的数量。目前，柑橘半穿刺线虫的鉴定主要还是通过形态学的方法， 然而通过形态学鉴定半穿刺线虫需要认真的观察线虫的形态和测量线虫线虫不同结构的 大小，这要求鉴定的人员有多年的线虫鉴定经验，专业要求很高。同时由于在土壤中往往会 有多种线虫同时存在，因此在测定柑橘半穿刺线虫的数量时容易造成把其他种类线虫也计 算为柑橘半穿刺线虫。此外，对每一份样品中的线虫数量都通过人力进行计算是一件非常 耗费时间的工作，往往还会造成测量很不准确，不适于同时鉴定和定量大批的样品。
[0004] 刘国坤首先开发出一种通过PCR方法鉴定柑橘半穿刺线虫的方法，但是该方法不 能实现定量检测的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有柑橘半穿刺线虫检测技术的不足，提供一种 准确、快速、特异性好、敏感性强的定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR方法。
[0006] 本发明的目的是提供一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和 探针。
[0007] 本发明另一目的是提供上述引物和探针的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，所述引 物包括上游引物TsFl和下游引物TsR2,上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针为Tsprol，探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 其中，所述探针Tsprol的5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基 团 ECL。
[0010] 上述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在检测和/或定量 检测柑橘半穿刺线虫方面的应用也在本发明的保护范围之内。
[0011] 上述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备检测和/或 定量检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用也应在本发明的保护范围之内。
[0012] 应用时，所述引物的优选退火温度为60°C。
[0013] 本发明还以上述引物和探针建立了一种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定 量PCR方法。
[0014] PCR反应体系为：I yL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0· 2 μΜ，探针Tsprol 0· 10 μ Μ，10 μ L实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH20,共20 μ L。
[0015] PCR反应条件为：预变性95°C 2min ;95°C 15s，退火温度60°C 15s和72°C 15s，共 30循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包含有实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚 合酶，缓冲液和dNTP。
[0016] 另外以上述引物和探针构建的柑橘半穿刺线虫的检测试剂盒也在本发明保护范 围之内。
[0017] 优选地，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和 dNTP〇
[0018] 更优选地，所述试剂盒为实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒的反应体系和反应 程序同上所述实时荧光定量PCR方法的反应体系和反应程序。
[0019] 上述实时荧光PCR方法或上述检测试剂盒在定量检测柑橘半穿刺线虫方面的应 用也在本发明保护范围之内。
[0020] 在实际应用工作中，利用本发明所设计的引物和探针检测柑橘半穿刺线虫时，大 致工作流程如下：首先提取待测样品的DNA，再利用本发明设计的引物和探针或本发明建 立的实时荧光PCR方法进行检测。对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方 法提取得到的样品DNA均可用于检测。
[0021] 本发明具有以下有益效果： 本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，不仅能 够在定性检测的同时，对柑橘半穿刺线虫进行定量分析，而且对柑橘半穿刺线虫有非常好 的特异性和灵敏性。
[0022] 利用该引物和探针可以从混合线虫样品中特异性的检测出柑橘半穿刺线虫，所述 混合线虫样品包括任意几种线虫的混合样品。另外，利用该引物和探针还可以从感染混合 线虫的基质样品中特异性的检测出柑橘半穿刺线虫，所述基质样品包括柑橘半穿刺线虫可 以感染或生存的任何介质，如土壤、培养基、苗木组织等等。
[0023] 而且，利用该引物和探针对柑橘半穿刺线虫的检测灵敏性可达到0. 1条线虫的灵 敏度，并且是从上述任意的混合线虫样品或基质中进行检测，灵敏性非常好，有着非常好的 应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1为电泳检测不同退火温度对扩增效率的影响。
[0025] 图2为电泳条带亮度分析不同退火温度对扩增效率的影响。
[0026] 图3为定量柑橘半穿刺线虫数量的标准曲线；R2表示相关系数；E表示引物的扩 增效率。Y轴表示的是Ct值，X轴表示的是柑橘半穿刺线虫的数量。
[0027] 图4为样品中混合有不同种类的线虫对检测和定量柑橘半穿刺线虫的影响。图中 Ts表示仅含有1条柑橘半穿刺线虫，Ts+Ce表示含有1条柑橘半穿刺线虫和100条秀丽小 杆线虫，Ts+Pc表示含有1条柑橘半穿刺线虫和100条咖啡短体线虫，Ce、Pc分别表示仅含 有100条秀丽小杆线虫线虫或100条咖啡短体线虫，CK表示加入灭菌水作为模板。Y轴表 示的是荧光值，X轴表示的是循环数。
[0028]
【具体实施方式】
[0029] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0030] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0031] 实施例1弓丨物设计和反应条件优化 1、引物设计 根据NCBI中柑橘半穿刺线虫的ITS DNA序列（基因登录号为：FJ969705、⑶433381 JNl 12270、JNl 12269、⑶433403、⑶433405 )设计 了引物 TsFl 和 TsR2,以及特异探针 Tsprol0
[0032] 引物和探针的序列为 上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示 5' -GATGCTTTTGCCCCGTTGTG-3' 下游引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示 5' -GGTAAGAGCCGAGAAGGACA-3， 探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示 5' -FAM-TCTACCAGGTTGAGCAGAGTCCTT-ECL-3'。
[0033] 2、引物反应条件优化 (1)使用柑橘半穿刺线虫DNA作为模板，分别以不同的退火温度进行PCR扩增，优化上 述引物的退火温度。
[0034] 所述DNA的提取按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行，具体如下：通过离心法收集线虫或在体视镜下挑取1条线虫，然后加 入 16 yL 灭菌双蒸水，2 yL 10XPCR buffer (无 Mg2+)(购于 Takara)和 2 yL 蛋白 酶K (600 mAnson U/mL)(购于Takara)，接着用针头切割线虫，随后把该混合物置于65°C 中 Ih 和 95°C 中 15min。
[0035] PCR