检测转基因玉米cbh351的引物、试剂盒和方法

文档序号:8917833阅读:610来源:国知局
检测转基因玉米cbh351的引物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的双重荧光PCR 检测试剂盒,本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界上最重要的粮食作物之一,在世界农业生产中占有重要位置。农业转 基因生物技术产业化的发展既是综合国力和竞争力的标志,又是国家科技竞争优势的重要 标志。农业转基因生物的推广应用,降低了生产成本,减轻了环境污染,提高了产品价格竞 争力。转基因作物使产量增加,农药使用量减少,形成了巨大经济和生态效益。国际上对转 基因生物安全性的争论已经不是纯粹的科学技术问题,包含政治、经济、伦理等诸多方面。 很多国家将他们研宄的转基因物种拿到发展中国家中进行试验研宄。在转基因产品的销 售过程中,经营者与消费者之间缺乏公平,消费者经常是在不知情或者是被动的情况下就 进行了消费。由此,我们需要对食品及饲料中转基因玉米的品系进行鉴定。为了加强对转 基因玉米特别是进口转基因玉米的品系鉴定,根据欧盟转基因品系准入相关文献,建立食 品和饲料中转基因玉米品系检测方法。CBH351Starlink ?玉米Z. mays是Aventis Crop Science即formerly AgrEvo公司运用现代生物技术手段开发的一种转基因玉米品系。其 导入的来自苏云杆菌Bt基因可产生一种蛋白质Cry9C,具有杀虫活性,能够有效控制欧洲 钻心螟虫。
[0003] 针对玉米中Zein基因和CBH351基因,研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方 法研宄。目前,我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR 检测方法》中规定了对玉米M0N810、Btll、Evebtl76、T14/T25、CBH351、GA21品系中转基因 成分的定性检测。此外,农业部953号公告-2-2007《转基因植物及其产品成分检测抗虫玉 米CBH351及其衍生品种定性PCR方法》标准规定了转基因抗虫玉米CBH351CBH351及其衍 生品种的检测。这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法和荧光PCR方法。
[0004] 但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳,不仅操作繁琐,而且容易引起污染,还 需要使用可能致癌的荧光燃料。而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确,但TaqMan探针的线 性结构导致了较高的背景荧光,如果荧光基团和淬灭基团的距离太近,在PCR扩增过程中, 探针在它们之间降解的可能性将大为降低,从而起不到探针的作用。相反,如果荧光基团和 淬灭基团分别置于探针两端,荧光背景信号加强,影响其检测的灵敏度。另外其合成成本较 高,而且试剂有效期短,很容易降解,因而,不能在基层得到广泛的应用。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处,提供一种用于检测转基因抗虫 玉米CBH351及内源基因 Zein的引物;
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种包括上述引物且组分和配比合理,使用方便,检 测快捷,准确,适用于双重荧光PCR检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂 盒;
[0007] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内 源基因 Zein,该方法操作简便、快速,成本低,检测结果准确。
[0008] 为了达到上述目的,本发明采用以下方案:
[0009] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的引物,其特征在于该引物的 序列分别为:
[0010] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0011] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0012] 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0013] 下游引物 CBH35IR :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0014] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein及内源基因 Zein的试剂盒,其 特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分:
[0015] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物Zein F 0.05- 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0 05- 0.8 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的上游引物 CBH351F 0.05- 0.9 μ L 终浓度 0.5 pmol/L 的下游引物 CBH351R 0.05- 0.9 μ L DNA模版 IuL 水 补齐至20 μ L;
[0016] 其中所述上游引物ZeinF的序列:TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0017] 所述下游引物 ZeinR 的序列:GTAATAGGGCTGATGATTG
[0018] 所述上游引物 CBH351F 的序列:TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0019] 所述下游引物 CBH351R 的序列:AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0020] 如上所述的一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的试剂盒,其特征 在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括以下组分:
[0021] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐至20 μ L。
[0022] 一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法,其特征在于包括以下 步骤:
[0023] A、提取样品DNA ;
[0024] Β、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增;
[0025] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析,并结合扩增曲线判定结果。
[0026] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法,其特征在于步骤 B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行:
[0027] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0028] (2)92。〇~95。〇变性1〇8~3〇8,54。〇~64。〇退火1〇8~3〇8,72。〇1〇8~3〇8,共 进行35~45个循环;
[0029] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0030] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法,其特征在于步骤 C中所述高分辨率熔解曲线分析,按以下步骤进行:
[0031] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0032] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0033] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C,开始程序升温熔解至90°C~95°C,并在熔解 过程中实时检测荧光信号,15~25次/秒。
[0034] 如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因 Zein的方法,其特征在于步骤 A中所述提取样品DNA的具体步骤如下:
[0035] 称取Ig样品,加入到50mL的离心管中;加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K 溶液,充分混匀。65°C孵育30min,不时振荡;吸水性大的食品样品,加入CTAB提取液的量 应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定;65°C过夜后,8000r/min室温离心10min,取 Iml上清液入2ml离心管中;加入700 μ L氯仿后用力振荡,13000g离心10min,转移上清液 600 μ L到新的2ml离心管中;加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min, 13000 Xg离心10min,弃去上清,加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮,再加入350 μ L氯 仿,涡旋振荡进行混匀,13000g离心10min,转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀 核酸,室温放置20min,13000g离心10min,弃去上清,加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀, 溶解于50 μ L TE溶液中。
[0036] 本发明中标准品模板的制备:
[0037] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析,采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收,将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接,将连接产物转化至 感受态细胞,筛选得到单菌落,挑选单菌落至含抗生素的液体培养基,过夜培养,提取质粒, 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定,并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒,并测定其浓度,将其10倍倍比稀释。
[0038] 本发明中敏感性和特异性试验:
[0039] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证,结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时,序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系,采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值, 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0040] 本发明与现有技术相比,具有以下优点:
[0041] 1)本发明试剂盒组分和配比合理,使用方便,检测快捷,准确,适用于荧光PCR检 测玉米Zein基因和CBH351基因;
[0042] 2)本发明检测方法简化了检测流程,大大缩短了检测周期,检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右;
[0043] 3)本发明检测方法整个过程,PCR产物无需再转入其它分析装置,实现闭管操作, 避免交叉
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