特异于clec14a的新抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新的抗体及其用途，所述抗体特异性结合c型凝集素结构域家族14 的成员A(clecl4a)。更具体地，本发明涉及特异性结合clecl4a的C型凝集素样结构域 (CTLD)的抗体，制备此抗体的方法，用于抑制血管生成的包含此抗体的组合物，通过施用抗 体或组合物来抑制血管生成的方法，用于预防或治疗癌症的包含抗体的组合物，通过施用 抗体或组合物来治疗癌症的方法，用于诊断癌症的包含抗体的组合物，用于诊断癌症的包 含此组合物的试剂盒，使用此组合物诊断癌症的方法，用于抑制血管生成的包含用于抑制 clecl4a表达的物质的组合物，用于血管生成的包含此组合物的试剂盒，使用组合物抑制血 管生成或治疗癌症的方法，以及clecl4a的CTLD作为抑制血管生成的抗体的表位的用途。
【背景技术】
[0002] 重组抗体技术近期的快速发展已在全球范围内产生了约30种被批准用于人类治 疗的抗体以及超过270种目前处于临床开发的用于范围广泛的疾病的抗体。然而，传统的 抗体筛选仍然是时间和劳动密集型的且是昂贵的。传统上，使用目标蛋白的胞外区域以筛 选抗体。因此，大多数所选择的抗体结合到细胞，但其不是具有治疗潜力的功能性抗体。由 于分子生物学和蛋白质生物化学的最新进展，大量的可以将蛋白质结构域和基序的结构与 细胞功能联系起来的信息是可用的。使用功能性结构域以筛选重组抗体可以是鉴定功能性 抗体和研宄潜在作用模式的一种有效的方法。
[0003] 肿瘤的血管生成在肿瘤的发展中起到了重要的作用。血管内皮生长因子 (VEGF)和表皮生长因子受体（EGFR)在血管生成中是关键的因素，并且靶向血管生成 已成为癌症治疗的有前途的策略。已经使用抗-VEGF抗体贝伐单抗（bevacizumab)来 治疗患有转移性结肠直肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、恶性脑胶质瘤的患者。西妥昔 单抗（Cetuximab)(其是抗-EGFR抗体）可以抑制内皮细胞与细胞的接触以及血管生 成因子如VEGF、白介素-8和碱性成纤维细胞生长因子的表达。然而，由于肿瘤分泌 的血管生成因子的冗余，其包括胎盘生长因子、血管生成素、碱性成纤维细胞生长因 子、肝细胞生长因子，这些药物在肿瘤中产生了抗性表型（KopetzS等人，PhaseII trialofinfusionalfluorouracil，irinotecan，andbevacizumabformetastatic colorectalcancer:efficacyandcirculatingangiogenicbiomarkersassociated withtherapeuticresistance.JournalofClinicalOncology.28 (3) :453-9 ; Lucio-EterovicAK等人，Mediatorsofglioblastomaresistanceandinvasionduring antivascularendothelialgrowthfactortherapy.ClinicalCancerResearch. 2009 ； 15(14) : 4589-99) 〇
[0004] 贝伐单抗（人VEGF抗体）现被用于治疗多种癌症患者。然而，由于VEGF受体 (VEGFR)也在正常细胞中表达，它的使用可能与包括高血压、蛋白尿和胃肠穿孔的副作用相 关。副作用也可能限制抗促血管生成因子如VEGFR-2和血管生成素-2的许多抗体的治疗 用途。因此，鉴定通过抑制血管生成来治疗癌症患者的新的癌症特异性靶标对于开发具有 较少副作用的治疗性抗体是至关重要的。
[0005] 此外，贝伐单抗和西妥昔单抗是治疗性抗体，其通过抑制可溶性血管生长因子与 它们的受体的相互作用来抑制血管生成。然而，由于肿瘤细胞分泌的促血管生成生长因子 的冗余，这些药物的长期使用产生了抗性肿瘤表型。这可能对在需要长期治疗的患者中使 用抗可溶性生长因子的抗体形成最大的挑战。
[0006]Clecl4a是I型跨膜蛋白，其细胞外结构域由C型凝集素样结构域（CTLD)、一系列 的表皮生长因子样结构域和寿司样结构域组成。一些报道表明了clecl4a在肿瘤血管生成 中的作用。Rho等人报道称，clecl4a是内皮细胞特异性的，并且可能在血管生成中的细胞 与细胞的接触中发挥了关键作用（RhoSS等人，Clecl4aisspecificallyexpressedin endothelialcellsandmediatescelltocelladhesion.Biochemical&Biophysical ResearchCommunications. 404(1): 103-8)。Mura等人表明，clecl4a对于调节与外肉伪 足形成、细胞迀移和内皮血管形成相关的促血管生成表型是至关重要的；这个小组还鉴 定了作为肿瘤内皮细胞标记物的clecl4a没有在正常组织的内皮细胞中表达（MuraM等 人，Identificationandangiogenicroleofthenoveltumorendothelialmarker CLEC14A.Oncogene. 31 (3):293-305)。
[0007] 尽管近年来对clecl4a的兴趣增加了，其分子机制尚未被清楚地鉴定。必须对 clel4a负责血管生成的功能部分或结构域进行研宄，以便挖掘和开发临床上可应用的抗 体。此时，迫切需求一种单克隆抗体，其特异性结合小鼠和人的clecl4a并可转换成人源化 抗体或人抗体，以用于临床前和临床研宄。优选地，需要一种抗体，其在临床上可用于抑制 肿瘤血管生成并从而治疗癌症。此外，需要鉴定一个新的部分，其抑制肿瘤血管生成并从而 进一步抑制血管生成并治疗癌症。
[0008]
【背景技术】部分所公开的上述信息仅用于增加对本发明背景的理解，因此其可能包 含本领域技术人员已知的不形成现有技术的信息。
【发明内容】
[0009] 技术问题
[0010] 本发明人首次鉴定了CTLD在细胞迀移和外肉伪足形成中的功能，其是血管生成 中的关键事件。通过使用噬菌体展示技术，本发明人开发了抗人和小鼠clecl4aCTLD的重 组人抗体。功能测定表明，所述抗体特异性抑制内皮细胞的迀移和血管的形成，而不影响活 力或活化。最后，本发明人提出了一种作用机制，借此，抗体可以通过调节CTLD介导的细胞 与细胞的相互作用并下调内皮细胞表面上的clecl4a表达来抑制血管生成。这些结果证明 了CTLD在血管生成中的功能重要性和CTLD特异性人抗体阻止clecl4a介导的肿瘤血管生 成的潜力。
[0011] 问题的解决方案
[0012] 为了达到上述目的，本发明提供了一种抗体，其特异性结合clecl4a(C型凝集素 结构域家族14,成员A)。
[0013] 本发明还提供了一种编码所述抗体的核酸。
[0014] 本发明还提供了包含所述核酸的载体。
[0015] 本发明还提供了一种宿主细胞，其包含所述载体或所述核酸。
[0016] 本发明还提供了一种生产所述抗体的方法，包括培养所述宿主细胞，使得所述核 酸表达以产生所述抗体。
[0017] 本发明还提供了一种抗体-药物偶联物，其包含附着到药物上的所述抗体。
[0018] 本发明还提供了一种用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包含所 述抗体。
[0019] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备预防或治疗血管生成相关疾病的药物组 合物的用途。
[0020] 本发明还提供了所述抗体，其用于预防或治疗血管生成相关疾病。
[0021] 本发明还提供了一种治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施 用所述抗体或所述药物组合物。
[0022] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的组合物，其包含所述抗体。
[0023] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备抑制血管生成的组合物的用途。
[0024] 本发明还提供了所述抗体，其用于抑制血管生成。
[0025] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用所 述抗体或所述药物组合物。
[0026] 本发明还提供了用于血管生成相关疾病的诊断组合物，其包含所述抗体。
[0027] 本发明还提供了一种所述抗体用于制备用于血管生成相关疾病的诊断组合物的 用途。
[0028] 本发明还提供了所述抗体，其用于血管生成相关疾病的体外诊断。
[0029] 本发明还提供了一种用于血管生成相关疾病的诊断试剂盒，其包含所述诊断组合 物。
[0030] 本发明还提供了一种用于诊断血管生成相关疾病的方法，其包括从疑似患有血管 生成相关疾病的受试者中分离的生物样品中通过抗原-抗体复合物检测clecl4a。
[0031] 本发明还提供了一种多肽，其包含Clecl4a的分离的CTLD，其用作能够诱导产生 抑制血管生成的抗体的表位。
[0032] 本发明还提供了一种多肽，其包含clecl4a的分离的CTLD的N-末端或C-末端， 作为能够诱导产生抑制血管生成的抗体的表位。
[0033] 本发明还提供了一种多肽，其包含clecl4a的CTLD中的第1个氨基酸至第42个 氨基酸的氨基酸片段或clecl4a的CTLD中的第122个氨基酸至第142个氨基酸的氨基酸 片段，其作为能够诱导产生抑制血管生成的抗体的表位。
[0034] 本发明还提供了一种用于制备特异性结合至clecl4a(C型凝集素结构域家族14， 成员A)的抗体的方法，其包括：使用所述多肽作为表位进行生物淘选。
[0035] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的组合物，其包括用于抑制clecl4a表达 的物质。
[0036] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的试剂盒，其包括所述组合物。
[0037] 本发明还提供了一种用于抑制血管生成的方法，其包括向有需要的受试者施用所 述组合物。
[0038] 本发明还提供了一种治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施 用所述组合物。
[0039] 本发明还提供了所述用于抑制clecl4a表达的材料用于制备抑制血管生成的组 合物的用途。
[0040] 本发明还提供了用于抑制Clecl4a表达的所述材料，其用于抑制血管生成。
[0041] 本发明还提供了用于预防或治疗血管生成相关疾病的药物组合物，其包括 clecl4a的CTLD和Fc的融合蛋白。
[0042] 本发明还提供了clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白用于制备预防或治疗血管 生成相关疾病的药物组合物的用途。
[0043] 本发明还提供了clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白，其用于预防或治疗血管 生成相关疾病。
[0044] 本发明还提供了一种用于治疗血管生成相关疾病的方法，其包括向有需要的受试 者施用clecl4a的CTLD和Fc的所述融合蛋白或所述药物组合物。
[0045] 从下列详细的描述和所附的权利要求将可以更加清楚地了解本发明的其它特征 和实施方式。
【附图说明】
[0046] 图1示出了clecl4aCTLD在细胞迀移中的作用。a.在光学显微镜下监测伤口愈 合测定中的转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞的迀移。在0小 时（上）和20小时（下）时捕捉图像。b?将迀移距离表示为对照迀移的百分比。数值代 表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0047] 图2示出了clecl4aCTLD对外肉伪足形成的作用。固定转染了GFP、clecl4a_GFP 和clecl4aACTLD-GFP的C0S-7细胞（a)和HUVEC(b)，用罗丹明-鬼笔环肽和Hoechst染 色，并通过荧光显微镜（1000X)进行检查。箭头表示外肉伪足形成区域。结果是三个独立 的实验的代表。
[0048] 图3示出了特异于人类和小鼠的CTLD的scFv克隆的分离。a.用Fc结合剂预清 洗合成的人类scFv抗体库并通过使用重组的hCTLD-Fc或mCTLD-Fc的交替生物淘洗进行 筛选。b-d.随机选择96个展示了scFv的噬菌体克隆（1-96)并通过噬菌体ELISA分析上 清液。通过测量450nm处的吸光度分析所选择的scFv克隆对人类和小鼠CTLD的反应性。 箭头表示与hCTLD-Fc( ，黑色）和与mCTLD-Fc(，灰色）反应的scFv克隆，以及不与 Fc( □)反应的scFv克隆。BSA(园）作为背景对照。
[0049] 图4示出了clecl4a_CTLDIgG与人和小鼠CTLD的交叉物种反应性。用纯化的、 所选择的IgGscFv克隆（克隆1-4)在包被有hCTLD-Fc( ，黑色）、mCTLD-Fc(，灰色） 和Fc(D)的96孔微量滴定板上进行ELISA。BSA(図）作为背景对照。数值代表了两个 独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0050] 图5示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞的迀移和血管形成的作用。a.受伤后， 通过光学显微镜监测在不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG(克隆1-4)或存在西妥昔 单抗的情况下孵育的HUVEC的迀移。在0小时（上）和9小时（下）时捕捉图像。b?将迀 移距离表示为对照（MOCK)迀移的百分比。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测 量的平均值土SD。C.在不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG(克隆1-4)或存在西妥 昔单抗的情况下分析血管的形成。D.血管形成的程度表示为对照（MOCK)血管形成的百分 比。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0051] 图6示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞增殖和活化的作用。a.在不存在（MOCK) 或存在clecl4a-CTLDIgG、西妥昔单抗或5-FU(阳性对照）的情况下孵育HUVEC2天。通 过测量450nm处的吸光度评估细胞活力。数值代表了两个独立实验之一的一式三份的测量 的平均值土SD。b?在不存在（虚线）或存在hTNFa、clec14a-CTLDIgG或西妥昔单抗（实 线）的情况下培养HUVEC;用抗-VCAM-1 (上）或ICAM-1 (下）多克隆抗体进行染色；并通 过流式细胞术进行分析。hTNFa作为内皮细胞活化的阳性对照。结果是三个独立实验的代 表。
[0052] 图7示出了clecl4a_CTLDIgG对clecl4a介导的细胞-细胞接触的作用。a?在 不存在（MOCK)或存在clecl4a-CTLDIgG或西妥昔单抗的情况下孵育转染了GFP和 clecl4a-GFP的HEK293F细胞8小时。在光学显微镜下计数细胞聚集体（细胞团>4个细 胞；箭头）。每视野的聚集体的数量示于b中。数值代表了三个独立实验之一的一式三份 的测量的平均值土SD。
[0053] 图8示出了clecl4a_CTLDIgG对CTLD-CTLD相互作用的作用。a?用抗-GFP或 抗-0 -肌动蛋白抗体通过免疫印迹对转染了GFP、clecl4a_GFP或clecl4aACTLD-GFP 的C0S-7细胞的裂解物进行分析。b.将表达GFP(白色）、clecl4a-GFP(黑色）或 clecl4aACTLD-GFP(浅灰色）的C0S-7细胞用0. 15yg的hCTLD-Fc或Fc进行孵育并通过 ELISA测定CTLD-CTLD相互作用。c.将转染了GFP或clecl4a-GFP的C0S-7细胞的裂解物 与hCTLD-Fc-起孵育，其中hCTLD-Fc已与增加浓度的clecl4a-CTLDIgG(克隆1) 一起预 孵育。数值代表了三个独立实验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0054] 图9示出了clecl4a_CTLDIgG对内皮细胞表面的clecl4a的下调的作用。a.在 存在（虚线）或不存在（实线）clecl4a-CTLDIgG(克隆1)的情况下孵育固定的和未固定 的HUVEC并通过流式细胞术进行分析。b.通过细胞ELISA分析与clecl4a-CTLDIgG(白 色）或Fc(黑色）一起孵育指定时间的HUVEC表面上的Clecl4a。数值代表了三个独立实 验之一的一式三份的测量的平均值土SD。
[0055] 图10示出了clecl4a_CTLDIgG对clecl4a的CTLD的部分片段的特异性。a.Fc 与clecl4a的CTLD的部分片段的融合蛋白。b.图分别示出了克隆1(上图）和克隆2(下 图）的clecl4a-CTLDIgG对Fc与clecl4a的CTLD的部分片段的融合蛋白、wtCTLD-Fc和 Fc的特异性。
[0056] 图11是示出了hCTLD-Fc对血管形成的抑制作用的图。
【具体实施方式】
[0057] 根据本发明的一个方面，本发明提供了特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家 族14,成员A)的抗体。
[0058] 优选地，抗体可以是特异性结合clecl4a(C型凝集素结构域家族14,成员A)的 CTLD(C型凝集素样结构域）的抗体。
[0059] 如本文所用，术语"抗体"是指一种蛋白分子，其包含对某一抗原具有免疫反应性 的免疫球蛋白分子，作为特异性识别抗原的受体，并包括多克隆抗体、单克隆抗体、完整抗 体和抗体片段。此外，嵌合抗体（如人源化鼠抗体）、二价或双特异性分子（如双特异性抗体(bispecificantibodies))、双特异抗体（diabodies)、三特异抗体和四特异抗体都在对本 发明有用的抗体的范围之内。完整的抗体由两个全长的轻链和两个全长的重链组成，在轻 链与重链之间有二硫键。在哺乳动物中，已知存在5种抗体同种型，称为IgA、IgD、IgE、IgM 和IgG，且IgG进一步分为四种亚型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。术语"抗体片段"是指至少 保留了抗原结合功能的片段，并且可包括Fab、F(ab'）、F(ab'）2和Fv。Fab包含各个重链和 轻链的一个可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区（CHI)，具有抗原结合位点。Fab'与 Fab的差异在于其进一步包括重链CH1结构域的C末端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab'）2 由两分子的Fab'和铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键组成。Fv(可变片段）包含每个重 链和轻链的一个可变区，其是包含亲本免疫球蛋白的原有特异性的最小抗体片段。通过利 用二硫键连接重链的可变区与轻链的可变区形成二硫键稳定的Fv(dsFv)。单链Fv(scFv) 是一种Fv，其中通过肽接头共价连接重链和轻链的各个可变区。可以通过使用蛋白酶（例 如，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整的抗体分别获得Fab或F(ab'）2)来获得这些抗体片 段，并优选可以通过基因重组技术来构建。
[0060] 照