一种楠木脂素a的提取分离方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种楠木脂素 A的提取分离方法与应用，具体是涉及一种应用高速逆 流色谱技术从红楠干燥树皮中分离纯化楠木脂素 A的方法，还涉及楠木脂素 A在抗肿瘤药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 红楠 Sieb. et Zucc.系棒科植物，主要分布于我国山东、江 苏、浙江、安徽、江西、福建、台湾、四川、广东、广西等省区。现代药理研宄表明，楠木脂素 A 具有免疫抑制活性，对分裂素(刀豆球蛋白A)诱导的人外周血液淋巴细胞增生有极强的抑 制作用，其IC5tl为0.02 μ g/ml，与强的松龙相当；另外还具有细胞毒活性，对人型白血病细 胞株HL-60和Molt-4细胞具有细胞毒活性，其IC 5tl (ng/ml)分别为26和54。
[0003] 楠木脂素 A (Machilin A)，分子式为C2tlH22O4，分子量为326. 39,为无色针晶，是从 红楠的树皮分离出的一种木脂素类化合物。
[0004] 现有提取楠木脂素 A的报道并不多见，市场上也尚未有楠木脂素 A对照品的出售， 因此提供一种楠木脂素 A的提取分离方法与应用则很有必要，可以为其后续研宄提供支 持。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种楠木脂素 A的提取分离方法与应用，本发明方法制得的 楠木脂素 A质量好，纯度高。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种楠木脂素 A的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 提取：将红楠干燥树皮粉碎，加入7-12倍药材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混 悬20-40min，进行负压空化混悬固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔树脂富集：萃取液回收乙醇得总生物碱浸膏，加入大孔树脂，拌匀、干燥后装 柱，醇水溶液洗脱，收集楠木脂素 A流分，浓缩得楠木脂素 A粗品； (3) 纯化：将上述粗品采用高速逆流色谱法分离纯化，以氯仿-甲醇-水为两相溶剂系 统，ELSD检测器监测，收集目标流分，回收试剂，真空干燥得产品。
[0007] 步骤（1)所述乙醇水溶液浓度为75%，用量为10倍药材重量。
[0008] 步骤（1)所述混悬时间为30min，萃取2次。
[0009] 步骤（2)所述萃取液浓缩至密度1. 1-1. 2g/ml。
[0010] 步骤（2)所述大孔树脂为DlOl型，醇水溶液为85%的乙醇溶液。
[0011] 步骤（3 )所述氯仿-甲醇-水体积比为（5-9 ) : (15-17 ) : (6-8 )。
[0012] 本发明提取分离方法制得的化合物在抗肿瘤药物中的应用。
[0013] 本发明提取分离方法制得的化合物进行抗肿瘤活性实验表明：该化合物具有较强 的抗肿瘤活性，在天然新药开发中具有良好的应用前景。
[0014] 本发明提取分离方法制得的楠木脂素 A采用MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应 比色法）进行抗肿瘤活性测试。
[0015] 试验用细胞株： HeLa :人子宫颈癌细胞株；HEC-I :人子宫内膜癌细胞株；T-98和U251-SP :人脑神经胶 质瘤细胞株；HLE :人肝癌细胞株；MMl-CB和HMV-I :人黑色素瘤细胞株。
[0016] 方法：（1) 0. 25%胰酶消化对数生长期细胞，10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度 50000个/ml。96孔板IOOul/孔。设溶剂对照，每组3平行孔。37°C，5%C0 2、95%空气的 培养箱中预培养24h，弃上清。
[0017] (2)加药物5个10倍稀释的浓度(溶剂为有二甲亚砜和水），为KT4 mol/L。
[0018] (3)细胞连续培养48h，每孔加入10 μ I 5mg/ml的MTT溶液（以无血清培养基配 制)，继续培养4h。
[0019] (4)吸去上清。加入200 μ1 DMS0,轻轻振荡以使甲臜完全溶解。570nm处用酶标 仪测定OD值。
[0020] (5)计算抑制率（%)=(对照OD-药物0D) /对照0D*100% 实验结果：本发明化合物的抑制率以相对于对照(添加 DMS0)的结果如下表1表示。
[0021] 表1楠木脂素 A的肿瘤细胞增值抑制率％
以上试验表明，楠木脂素 A具有良好的抑制肿瘤细胞生长的活性，其可在制备抗肿瘤 药物中得到应用。
[0022] 本发明为制备抗肿瘤药物提供了一种新的选择。
[0023] 本发明所述楠木脂素 A在制备抗肿瘤药物时，可按照常规的制剂方法以楠木脂素 A为药物活性成分，添加适宜的药物载体，制成各种药物剂型，如片剂、胶囊、滴丸、注射剂、 缓控释剂等等。
[0024] 在用于治疗肿瘤疾病时，口服制剂的用量一般可控制在每日服用楠木脂素 A200-500mg。其他剂型的用量可参考该用量。本发明的药物用法用量，也不完全限于此，临 床医师也可以根据病人的具体情况决定药物的用法用量。
[0025] 下面将结合【具体实施方式】进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限 于下列实施方式。
[0026]
【具体实施方式】： 实施例1 : 取红楠干燥树皮lkg，粉碎成粗粉，与10kg75%的乙醇溶液混合后，空化混悬30min，进 行负压空化混悬固液萃取2次，得到萃取液，浓缩至密度I. 2g/ml，得总生物碱浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔树脂拌匀、干燥后装柱，先用水洗至色浅，再用6倍柱体积的85%的乙醇溶 液洗脱，薄层检测，收集目标流分，浓缩得粗品。
[0027] 取氯仿-甲醇-水按（5:15:6)体积比置于分液漏斗中，混匀后，静置，放出上层作 为固定相，下层作为流动相，将粗品用下相溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，先将固定相 泵入色谱柱中，再以4ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制转速为850r/ min，ELSD检测器监测，收集流出液，浓缩，干燥得楠木脂素 A，检测含量96. 4%。
[0028] 实施例2 : 取红楠干燥树皮2kg，粉碎成粗粉，与20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混悬30min，进 行负压空化混悬固液萃取2次，得到萃取液，浓缩至密度I. 2g/ml，得总生物碱浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔树脂拌匀、干燥后装柱，先用水洗至色浅，再用5倍柱体积的85%的乙醇溶 液洗脱，薄层检测，收集目标流分，浓缩得粗品。
[0029] 取氯仿-甲醇-水按（9:17:8)体积比置于分液漏斗中，混匀后，静置，放出上层 作为固定相，下层作为流动相，将粗品用下相溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，先将固定 相泵入色谱柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制转速为 900r/min，ELSD检测器监测，收集流出液，浓缩，干燥得楠木脂素 A，检测含量97. 2%。
[0030] 实施例3 : 取红楠干燥树皮2kg，粉碎成粗粉，与20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混悬30min，进 行负压空化混悬固液萃取2次，得到萃取液，浓缩至密度I. lg/ml，得总生物碱浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔树脂拌匀、干燥后装柱，先用水洗至色浅，再用6倍柱体积的85%的乙醇溶 液洗脱，薄层检测，收集目标流分，浓缩得粗品。
[0031] 取氯仿-甲醇-水按（7:16:7)体积比置于分液漏斗中，混匀后，静置，放出上层作 为固定相，下层作为流动相，将粗品用下相溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，先将固定相 泵入色谱柱中，再以4ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制转速为1000 r/ min，ELSD检测器监测，收集流出液，浓缩，干燥得楠木脂素 A，检测含量97. 0%。
[0032] 实施例4 : 取红楠干燥树皮2kg，粉碎成粗粉，与20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混悬30min，进 行负压空化混悬固液萃取2次，得到萃取液，浓缩至密度I. 2g/ml，得总生物碱浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔树脂拌匀、干燥后装柱，先用水洗至色浅，再用5倍柱体积的85%的乙醇溶 液洗脱，薄层检测，收集目标流分，浓缩得粗品。
[0033] 取氯仿-甲醇-水按（8:15:7)体积比置于分液漏斗中，混匀后，静置，放出上层 作为固定相，下层作为流动相，将粗品用下相溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，先将固定 相泵入色谱柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制转速为 950r/min，ELSD检测器监测，收集流出液，浓缩，干燥得楠木脂素 A，检测含量96. 3%。
[0034] 实施例5 : 本发明药物颗粒剂 将实施例1所制楠木脂素 A加入乙醇作黏合剂，加入淀粉作填充剂，制成颗粒。
[0035] 实施例6 : 本发明药物片剂 将实施例1所制楠木脂素 A，加入淀粉、糊精、硬脂酸镁等，混合制成湿粒，压片，每片含 楠木脂素 A200mg。
【主权项】
1. 一种楠木脂素A的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 提取：将红楠干燥树皮粉碎，加入7-12倍药材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混 悬20-40min，进行负压空化混悬固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔树脂富集：萃取液回收乙醇得总生物碱浸膏，加入大孔树脂，拌匀、干燥后装 柱，醇水溶液洗脱，收集楠木脂素A流分，浓缩得楠木脂素A粗品； (3) 纯化：将上述粗品采用高速逆流色谱法分离纯化，以氯仿-甲醇-水为两相溶剂系 统，ELSD检测器监测，收集目标流分，回收试剂，真空干燥得产品。2. 如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于步骤（1)所述乙醇水溶液浓度为 75%，用量为10倍药材重量。3. 如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于步骤（1)所述混悬时间为30min，萃 取2次。4. 如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于步骤（2)所述萃取液浓缩至密度 I. 1-1. 2g/ml〇5. 如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于步骤（2)所述大孔树脂为DlOl型， 醇水溶液为85%的乙醇溶液。6. 如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于步骤（3)所述氯仿-甲醇-水体积 比为（5-9) : (15-17) : (6-8)。7. 如权利要求1~6所述提取分离方法制得的化合物在抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种楠木脂素A的提取分离方法与应用，提取分离方法包括以下步骤：（1）将红楠干燥树皮粉碎，加入乙醇水溶液，进行负压空化混悬固液萃取，得到萃取液，萃取液回收试剂得总生物碱浸膏；（2）总生物碱浸膏加入大孔树脂，拌匀、干燥后装柱，醇水溶液洗脱，收集楠木脂素A流分，浓缩得楠木脂素A粗品；（3）将上述粗品采用高速逆流色谱法分离纯化得楠木脂素A。本发明方法具有所得产品含量高，操作简单，提率高等优点。本发明方法所制化合物为开发应用新一代天然来源的抗肿瘤药物开拓了新径。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/36, C07D317/50
【公开号】CN104910126
【申请号】CN201510266004
【发明人】刘东锋, 杨成东
【申请人】南京泽朗医药科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月22日