用于磺达肝癸钠质量控制的参比化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明医药技术领域，涉及一种用于磺达肝癸钠原料药的质量检测方法，及相关 的五个参比化合物。 技术背景
[0002] 磺达肝癸钠是法国Sanofi Winthrop Industrie研制生产的第一个抗凝血酶依赖 性的Xa因子的间接抑制剂，经过50多步全合成的具有跨时代意义的抗凝血药物。
[0003] 磺达肝癸钠是一种肝素五糖类药物，其英文名为Fondapar inux sodium， 中文化学名称为：甲基0-(2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄 糖）-(1 - 4)-〇-(f3-D-吡喃葡萄糖醛酸）-(1 - 4)-0-(2-脱氧-3,6-0-二磺酸 基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- (2-0-磺酸基-a -L-吡喃艾杜糖醛 酸）-(1 - 4) -2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖苷十钠盐，化学结构 式如下（用DEFGH分别表示从左至右5个单糖）：
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[0005] 磺达肝癸钠的结构复杂，合成路线长，在降解和合成过程中会产生一些杂质。目前 国内未见涉及磺达肝癸钠杂质研宄的文献专利报导，国外的相关报导也很少，只是对磺达 肝癸钠杂质进行HPLC定位和结构推测，且没有专门对磺达肝癸钠杂质进行分离和结构鉴 定。
[0006] 申请人认为对磺达肝癸钠杂质进行研宄非常有必要，不仅有助于提高磺达肝癸钠 的纯度，而且可以进一步提高产品的质量标准。
[0007] 由于磺达肝癸钠与杂质之间的极性相近，因此，杂质的分离难度极大；并且杂质的 含量很少，很难通过普通的方法进行制备分离。此外，由于杂质的分子量大，结构复杂，需要 一定量的杂质才能满足HPLC、MS与NMR等分析检测，因此，很难制备分离得到足量的杂质对 其进行结构鉴定。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供磺达肝癸钠的相关参比化合物。
[0009] 本发明所述的参比化合物也称为杂质。
[0010] 本发明所述的磺达肝癸钠的相关参比化合物，包括参比化合物A(RrtO. 45)、参 比化合物B (RrtO. 54)、参比化合物C (RrtO. 77)，参比化合物D (RrtO. 93)、参比化合物 E (RrtL 20)。 toon] 这些参比化合物可以为磺达肝癸钠的质量研宄、质量控制和安全性研宄的提供基 础。此外，还可以进一步对其进行药理学和毒理学的研宄，寻找其潜在的药理方面的作用。
[0012] 本发明所述的5个磺达肝癸钠的相关参比化合物，分别为相对保留时间RrtO. 45、 RrtO. 54、RrtO. 77、RrtO. 93 和 RrtL 20。
[0013] 其中RrtO. 45、RrtO. 54、RrtO. 77为降解杂质，通过化学合成得到；RrtO. 93和 Rrt 1. 20为合成杂质，从磺达肝癸钠粗品中分离得到。
[0014] 这些杂质中，RrtO. 93为已知化合物，RrtO. 54和RrtO. 77已被usp37公开， RrtO. 45和RrtL 20是未知杂质，属于新的化合物，目前国内外文献专利未对其进行报导。
[0015] 其中，降解杂质：参比化合物A(RrtO. 45)、参比化合物B(RrtO. 54)、参比化合物 C(RrtO. 77)
[0016] 参比化合物A(RrtO. 45)，中文化学名称为：甲基0-2-氨基-(2-脱氧-6-0-磺 酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖）_ (1 - 4)-0-6-羧基_( β -D-吡喃葡萄糖 醛）-酰胺-(1 - 4) -0- (2-脱氧-3, 6-0-二磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄 糖）-(1 - 4)-0-(2-0-磺酸基-a-L-吡喃艾杜糖醛酸）-(1 - 4)-2-脱氧-6-0-磺酸 基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖苷六钠盐，化学结构式如下（用D、E、F、G、H分别表示 从左至右5个单糖）：
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[0018] 参比化合物B (RrtO. 54)，中文化学名称为：甲基0- (4-脱氧-2-磺酰基-a -L-吡 喃-己-4-烯糖酸）-(1 - 4) -2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖苷四 钠盐，化学结构式如下（用G、H分别表示从左至右2个单糖）：
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[0020] 参比化合物C (RrtO. 77)，中文化学名称为：甲基0- (2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰 胺基-a -D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- ( β -D-吡喃葡萄糖醛酸）-(1 - 4) -0- (2-脱氧-3， 6-0-二磺酸基-2-氨基-a -D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- (2-0-磺酸基-a -L-吡喃艾杜糖 醛酸）-(1 - 4) -2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖苷九钠盐，化学结 构式如下（用D、E、F、G、H分别表示从左至右5个单糖）：
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[0022] 合成杂质：参比化合物D (RrtO. 93)、参比化合物E (RrtL 20)
[0023] 参比化合物D (RrtO. 93)，中文化学名称为：甲基0- (2-脱氧-6-0-磺酸基-2-甲酰 胺基-a -D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- ( β -D-吡喃葡萄糖醛酸）-(1 - 4) -0- (2-脱氧-3， 6-0-二磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- (2-0-磺酸基-a -L-吡喃艾 杜糖醛酸）-(1 - 4) -2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖苷九钠盐，化 学结构式如下（用D、E、F、G、H分别表示从左至右5个单糖）：
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[0025] 参比化合物E (Rrt 1.20)，中文化学名称为：甲基0-(2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰 胺基-a -D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- ( β -D-3, 6-吡喃葡萄糖醛酸酯）-(1 - 4) -0- (2-脱 氧-3，6-0-二磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖）-(1 - 4) -0- (2-0-磺酸基-a -L-吡 喃艾杜糖醛酸）-(1 - 4) -2-脱氧-6-0-磺酸基-2-磺酰胺基-a -D-吡喃葡萄糖苷九钠盐， 化学结构式如下（用D、E、F、G、H分别表示从左至右5个单糖）：
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[0027] 本发明的另一个目的在于提供磺达肝癸钠有关参比化合物的制备方法。
[0028] 本发明所述磺达肝癸钠的参比化合物的获得途径，通过合成，以及从磺达肝癸钠 粗品中分离得到。
[0029] 具体而言，本发明所述参比化合物A(RrtO. 45)的制备方法，包括以下步骤：
[0030] 称取磺达肝癸钠纯品I. 5g于500ml圆底烧瓶中，再向其中加入300ml lmol/L的 HCl水溶液，油浴40°C，搅拌18h后会产生酸降解参比化合物A(RrtO. 45)。加入lmol/L的 NaOH调节PH至碱性，葡聚糖凝胶G-25层析柱脱盐，减压浓缩至干，得参比化合物A粗品。
[0031] 称取参比化合物A粗品，用纯化水溶解，采用高效制备液相色谱仪，选择强碱型阴 离子交换色谱柱DIONEX CarboPac TMPAl (250X9mm)，少量多次地进行上样分离，流速为 5. Oml/min，紫外波长为210nm，流动相A、B进行梯度洗脱（流动相A : 117g/L氯化钠水溶液， 流动相B :注射用水），梯度如表所示：
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[0033] 采集8. Omin-11. 3min的流出液，葡聚糖凝胶G-25层析柱脱盐，减压浓缩后得到白 色固体参比化合物A (RrtO. 45)。
[0034] 本发明所述参比化合物E (RrtL 20)的制备方法，包括以下步骤：
[0035] 在液相制备分离磺达肝癸钠时，将其流出液分成三个组分："前杂"、"主峰"和"后 杂"，参比化合物E存在于"后杂"组分中，经葡聚糖凝胶G-25层析柱脱盐，减压浓缩至干， 得参比化合物E粗品。
[0036] 其中"主峰"为液相中磺达肝癸钠的紫外吸收峰，"前杂"为"主峰"之前5min内的 紫外吸收峰，"后杂"为"主峰"之后3min内的紫外吸收峰。
[0037] 称取参比化合物E(Rrtl. 20)粗品，采用高效制备液相色谱仪，选择强碱型阴离子 交换色谱柱DIONEX CarboPac TMPAl (250 X 9mm)，少量多次地进行上样分离，流速为5. Oml/ min，紫外波长为210nm，流动相A、B进行梯度洗脱（流动相A : 117g/L氯化钠水溶液，流动 相B :注射用水），梯