一种小鼠皮肤组织trpv3蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物组织蛋白提取领域，具体涉及一种小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提 取方法。
【背景技术】
[0002] TRPV3蛋白是一类表达于细胞膜上的非选择性阳离子通道蛋白，它能被温度及化 合物2-APB，camphor等激活。它在大脑、肺部、肝脏和皮肤组织中都有广泛的表达，尤其是 在皮肤组织角质形成细胞中的表达量比较高，它参与了皮肤角质屏障的形成，皮肤温度的 感知，皮肤炎症的发生及导致罕见皮肤病Olmsted syndrome等，因此使得皮肤角质形成细 胞TRPV3蛋白的研宄成为了热门。在一些病理生理条件下，TRPV3在皮肤组织中的蛋白表 达量会发生上调或者下调的变化，要检测这个表达量变化的幅度就得提取皮肤中TRPV3蛋 白进行western blot量化分析。目前提取皮肤组织TRPV3蛋白使用得最多的是成年小鼠 皮肤，它的常规提取过程简单描述为：处死成年小鼠；拔净毛发，用手术剪将小鼠背部皮肤 剪下一小块，称量重量，放入EP管中；用手术剪子将皮肤块剪碎；往EP管中加入组织裂解 液（M-PERK \lammalian Protein Extraction Reagent，Pierce);用电动组织研磨器研磨 皮肤组织；待皮肤组织被研磨成匀浆时用枪吹打均匀；置冰上一段时间待裂解液充分将组 织裂解；离心取上清蛋白进行蛋白浓缩用于下一步实验分析。成年小鼠皮肤外表皮是一层 坚韧的角质层，在提取蛋白的过程中，这层表皮很难被裂解液裂解，而往往要借助于电动组 织研磨器，研磨的时间也需要比较长，即便如此，最后提取到的蛋白总量也很低，而要提取 到合适的TRPV3蛋白就更难上加难，甚至最后检测时往往检测不到TRPV3蛋白，因为要裂解 皮肤组织就需要加入大量的裂解液，这会导致TRPV3蛋白被严重稀释，因此需要进行额外 的蛋白浓缩后才能进行下一步的western blot实验，此外由于皮肤组织中有很多蛋白质， 浓缩后的蛋白总量中，TRPV3占总蛋白的总量还是比较少，跑蛋白胶的结果很难用于定量分 析。因此，有效的提取TRPV3蛋白成为一个需要解决的技术难题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种操作简单、能高效获取TRPV3蛋白的小鼠皮肤组织 TRPV3蛋白的提取方法。
[0004] 本发明的小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法，其特征在于，将新生小鼠的皮肤 组织用中性蛋白酶处理分离出外表皮，以该皮肤外表皮为材料提取TRPV3蛋白。
[0005] 优选，所述的小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法，具体步骤如下：
[0006] 将出生1~2天的小鼠处死后，剪下其皮肤组织，清洗，将清洗后的皮肤组织按照 外表皮在上的方式放置，加入质量分数2. 5%的中性蛋白酶（dispase分散酶，购自Sigma公 司）在4°C条件下浸润（浸润皮肤块即可，蛋白酶液不能覆盖皮肤块）10h，将皮肤外表皮从 皮肤组织块上剥下，清洗后吸干残余液体，称量，将皮肤外表皮剪碎，按每50mg皮肤外表皮 加入 500 μ 1 裂解液（M-PER? VIammalian Protein Extraction Reagent，购自 Pierce 公 司）的量加入裂解液，研磨，混匀，裂解完全后，再离心收集的蛋白上清液即为含TRPV3蛋白 的溶液。
[0007] 所述的剪下其皮肤组织是剪下其背部的皮肤组织。
[0008] 所述的清洗是用PBS溶液清洗2-5次。
[0009] 所述的离心，其条件优选为4°C，12000rpm离心10min。
[0010] 本发明独创性的使用了新生小鼠（出生1~2天的小鼠）的皮肤组织来提取TRPV3 蛋白，由于TRPV3主要表达于皮肤角质形成细胞中，皮肤角质形成细胞主要存在于外表皮 及毛囊中，不同于成年小鼠皮肤组织外表皮的坚韧，新生小鼠的外表皮还未形成坚韧的角 质层，而是主要由角质形成细胞组成，很容易通过中性蛋白酶分离，将分离出来的新生小鼠 皮肤外表皮用于提取TRPV3蛋白会很高效，提取的TRPV3蛋白量会比较高，而且操作过程比 较简单，所用的中性蛋白酶量也比较少，相对于从成年小鼠皮肤提取蛋白来说，这个方法更 加简单高效。
【附图说明】
[0011] 图1是实施例1的蛋白质免疫印迹图，其中TRPV3蛋白约为90kDa，GAPDH蛋白约 为30kDa ;图2是实施例1的蛋白质相对定量图。
【具体实施方式】
[0012] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0013] 以下实施例中所用中性蛋白酶为dispase分散酶，购自Sigma公司；所用裂解液为 M-PER? Mammalian Protein Extraction Reagent，购自 Pierce 公司。
[0014] 实施例1
[0015] 1、将出生2天的小鼠用手术钳夹住脖子处死；
[0016] 2、用手术剪子将背部皮肤组织剪下，PBS清洗两次；
[0017] 3、将皮肤组织按照外表皮在上的方式置于平皿中，加入质量分数2. 5%的中性蛋 白酶溶液4°C浸润（浸润皮肤块即可，蛋白酶液不能覆盖皮肤块）IOh进行酶解，以分离外表 皮；
[0018] 4、用手术镊子轻轻在皮肤组织块上将外表皮剥下，其为半透明的薄薄一层，PBS清 洗5次，置于滤纸上吸干PBS，称量重量；
[0019] 5、用手术剪子将皮肤外表皮剪碎，按每50mg皮肤外表皮加入500 μ 1裂解液的量 加入裂解液，用电动研磨器研磨5s，用枪吹打均匀；
[0020] 6、置于冰上30min，每隔IOmin用枪吹打一次；
[0021] 7、4°C，12000rpm离心10min，收集的蛋白上清液即为含有TRPV3蛋白的溶液，用于 下一步实验分析。
[0022] 参考常规方法，利用成年小鼠皮肤组织提取TRPV3蛋白质并进行浓缩，作为对照。 具体方法为：处死成年小鼠；将毛发拔净，用手术剪将小鼠背部皮肤剪下一小块，称量重 量；用手术剪子将皮肤块尽量剪碎；按每50mg皮肤组织加入500 μ 1裂解液的量往EP管已 经剪碎的皮肤组织中加入裂解液；用电动组织研磨器研磨皮肤组织5s，置于冰上，由于成 年小鼠皮肤组织的外表皮比较坚韧，得进行多次研磨，因此每隔5min研磨一次，直至皮肤 组织被研磨成匀浆；静置于冰上30min，每隔IOmin用枪吹打一次，待裂解液充分将组织裂 解；4°C，12000rpm离心10min，用EP管按每管250 μ 1体积的量收集上清蛋白液置于-80°C 冰箱中直到将蛋白液冷冻成冰块；将EP管中冻成冰的蛋白样品置于真空干燥仪中干燥7~ 8h浓缩蛋白样品（干燥7~8h约能将蛋白样品浓缩一倍）；将进行了浓缩的蛋白样品用于 下一步实验分析。
[0023] 将利用上述两种不同方法提取得到的蛋白上清液用蛋白质免疫印迹方法进行比 较分析，结果如图1和图2所示，同样的组织量，利用新生小鼠皮肤组织外表皮提取TRPV3 蛋白质（本实施例的方法，图1和图2中新生小鼠皮肤组织外表皮）无需额外进行蛋白质浓 缩，而用成年小鼠皮肤组织提取TRPV3蛋白质（对照，图1和图2中成年小鼠皮肤组织）需 要进行额外的蛋白质浓缩。将利用新生小鼠皮肤组织外表皮提取TRPV3蛋白质和利用成年 小鼠皮肤组织提取TRPV3蛋白质这两种方法进行比较，跑蛋白胶时两者采用一样的上样体 积，后者的内参蛋白量比如者尚即总蛋白量比如者尚，而如者的TRPV3蛋白质的量比后者 高出很多，如图1所示。对两种方法提取的TRPV3蛋白质进行定量分析发现，两者的TRPV3 蛋白质总量差距很大，利用新生小鼠皮肤组织外表皮提取TRPV3蛋白质比利用成年小鼠皮 肤组织提取TRPV3蛋白质的相对总量（TRPV3蛋白量除以内参蛋白量）高了三倍，如图2所 示。由此表明，利用新生小鼠皮肤组织外表皮提取TRPV3蛋白质方法比常规方法更高效。
[0024] 实施例2
[0025] 本实施例与实施例1基本相同，只是使用的是出生1天的小鼠作为材料进行TRPV3 蛋白的提取。与实施例1 一样，本实施例也获得了相类似的结果，由此表明，利用新生小鼠 皮肤组织外表皮提取TRPV3蛋白质方法比常规方法更高效。
【主权项】
1. 一种小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法，其特征在于，将新生小鼠的皮肤组织用 中性蛋白酶处理分离出外表皮，以该皮肤外表皮为材料提取TRPV3蛋白。2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 将出生1~2天的小鼠处死后，剪下其皮肤组织，清洗，将清洗后的皮肤组织按照外表 皮在上的方式放置，加入质量分数2. 5%的中性蛋白酶在4°C条件下浸润10h，将外表皮从 皮肤组织块上剥下，清洗后吸干残余液体，称量，将皮肤外表皮剪碎，按每50mg皮肤外表皮 加入500y1裂解液的量加入裂解液，研磨，混匀，裂解完全后，再离心收集的蛋白上清液即 为含TRPV3蛋白的溶液。3. 根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述的中性蛋白酶为dispase分 散酶。4. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的裂解液为M-PER?Mammalian ProteinExtractionReagent。5. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的皮肤组织是新生小鼠背部的 皮肤组织。6. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的清洗是用PBS溶液清洗2-5 次。7. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的离心为4°C，12000rpm离心 10min〇
【专利摘要】本发明公开了一种小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法。其是通过将出生1-2天的小鼠处死，剪下其皮肤组织，清洗；将皮肤组织按照外表皮在上的方式放置，加入2.5％的中性蛋白酶在4℃条件下浸润10h，然后将外表皮从皮肤组织块上剥下，清洗后用滤纸吸干，称重，将外表皮剪碎，按500μl/50mg外表皮的量加入裂解液，研磨，混匀，置于冰上30min，保持混匀；4℃，12000rpm离心10min；收集的蛋白上清液即含TRPV3蛋白。不同于现有技术中使用成年小鼠皮肤组织提取TRPV3蛋白的方法，本发明独创性的使用了新生小鼠皮肤组织外表皮来提取TRPV3蛋白，提取的TRPV3蛋白量高，操作过程简单，所用的中性蛋白酶量也比较少，相对于从成年小鼠皮肤提取蛋白来说，这个方法更加简单高效。
【IPC分类】C07K14/47, C07K1/14
【公开号】CN104910267
【申请号】CN201510290429
【发明人】李志远, 李彩月, 马文波
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月29日