一种无血清培养基及其配制方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种无血清培养基及其配制方法，属于细胞培养技术领域。
【背景技术】
[0002]无血清培养基是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，可以应用于培养免疫细胞，例如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞、B细胞、NK细胞等)、树突状细胞(也称DC细胞)、单核/巨噬细胞等。
[0003]通常来说，免疫细胞在体外存活和扩增所需要的营养物质包括:白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、氨基酸、维生素、糖、脂质、无机盐、生长因子等。这些成分中，白蛋白对细胞生长和存活的影响最大，也是功能和组成最复杂的成分。而无血清培养基中，白蛋白所发挥的功能主要是由它所携带的脂肪酸和微量元素等成分决定的。
[0004]不同来源的白蛋白，例如不同种属的牛白蛋白和人白蛋白，它们所携带的脂肪酸差异很大；例如，重组白蛋白与人血白蛋白所携带的脂肪酸不同；例如在重组白蛋白中，水稻胚乳提取的与酵母菌发酵生产的重组白蛋白所携带的脂肪酸不同；不同产地的，也有不同。另外，后期生产加工过程也会造成白蛋白所携带的脂肪酸差异，例如不同生产厂家生产的、不同的批次的白蛋白所携带的脂肪酸也有很大的不同。总之，以上这些差异就导致添加了白蛋白的无血清培养基的成分复杂、不稳定。
[0005]无血清培养基中添加的白蛋白，其所携带的脂肪酸被细胞摄取后，用于构建细胞膜结构、信号传导分子、转化成能量、或者参与其它物质的合成等。因此，培养基中的白蛋白所携带的脂肪酸的差异会影响到免疫细胞的生长增殖、细胞功能等各个方面。特别是，往往某些脂肪酸含量过高或过低也会不利于免疫细胞的增殖及其杀伤活性，比如过高含量的亚麻酸或过低含量的亚油酸对免疫细胞增殖和杀伤活性不利。
[0006]特别是，对于淋巴细胞来说，体外富集、活化，并扩增淋巴细胞，可用于回输治疗多种诸如恶性肿瘤、感染、自身免疫病的疾病。然而，在体外扩增的过程中，需要用到适宜体外支持淋巴细胞存活和扩增的培养基。
[0007]目前，一些文献公开了一些无血清培养基，例如适合培养T淋巴细胞和DC细胞的无血清培养基，但都没有公开针对白蛋白的组成复杂性的解决方案。
【发明内容】
[0008]鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明提供了一种成分更稳定的无血清培养基及其配制方法，改善了因白蛋白的组成复杂性而导致的培养基成分不稳定的情况。
[0009]本发明一方面提供了一种无血清培养基的配制方法，所述无血清培养基包括基础培养基和适用于所述无血清培养基的血清替代物，所述血清替代物包括白蛋白、人转铁蛋白、胰岛素和胆固醇，该配制方法包括以下步骤:步骤一，获取无脂肪酸白蛋白；步骤二，将脂肪酸负载到所述无脂肪酸白蛋白上以获得白蛋白溶液；步骤三，配制无血清培养基:将步骤二所获得白蛋白溶液，以及除白蛋白以外的其他血清替代物溶解到所述基础培养基中，以获得无血清培养基。
[0010]优选的，所述步骤二中，将特定的脂肪酸负载到所述无脂肪酸白蛋白上；所述特定的脂肪酸包含棕榈酸和/或硬脂酸、油酸和亚油酸；所述步骤二中，按照每Immol无脂肪酸白蛋白添加0.l-2mmol的棕榈酸和/或硬脂酸，0.l-2mmol的油酸和0.l-2mmol的亚油酸的比例，将所述特定的脂肪酸添加到所述无脂肪酸白蛋白的溶液中混合，以获得白蛋白溶液。
[0011]优选的，所述特定的脂肪酸还包含花生四烯酸，所述花生四烯酸与所述亚油酸的添加量的比值为1:6?1:1。
[0012]优选的，所述特定的脂肪酸包括棕榈酸和硬脂酸、油酸和亚油酸，所述硬脂酸与所述棕榈酸的添加量的比值为1:6?1:1。
[0013]优选的，步骤二中，将所述特定的脂肪酸用无水乙醇溶解后，再添加到所述无脂肪酸白蛋白的溶液，在0-37.5°C摄氏度的条件下，搅拌混合达4小时以上。
[0014]优选的，步骤三中，按照每IL基础培养基添加0.015?0.15mmol白蛋白的比例，将步骤二所获得的白蛋白溶液添加到基础培养基中。
[0015]优选的，采用树脂吸附或活性炭吸附的方法将白蛋白上所携带的脂肪酸去除，以获得无脂肪酸白蛋白。
[0016]优选的，所述的白蛋白为牛血清白蛋白、人血白蛋白或重组人血白蛋白。
[0017]优选的，所述的重组人血白蛋白为水稻胚乳表达的重组人血白蛋白或者转基因酵母菌表达的重组人血白蛋白。
[0018]其中，植物源重组人血白蛋白是指利用基因重组技术在植物中表达的人血白蛋白，例如，武汉禾元生物科技有限公司生产的重组人血白蛋白(OsrHSA);转基因酵母菌表达的重组人血白蛋白是指利用基因重组技术在酵母菌中表达的人血白蛋白，例如，华北制药集团有限责任公司生产的重组人血白蛋白。
[0019]优选的，所述的基础培养基为IMDM培养基，以基础培养基的体积为基准，所述人转铁蛋白的添加量为I?100mg/L，所述胰岛素的添加量为I?100mg/L，所述胆固醇的添加量为I?10mg/Lo
[0020]优选的，所述血清替代物还包含乙醇胺，其添加量为I?10mg/L，以基础培养基的体积为基准。
[0021]优选的，步骤三中，将所述无血清培养基的pH值调节到6.8?7.5之间。
[0022]本发明另一方面还提供了一种无血清培养基，所述无血清培养基包括基础培养基和适用于所述无血清培养基的血清替代物，所述血清替代物包含白蛋白、人转铁蛋白、胰岛素和胆固醇，所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载脂肪酸而形成的。
[0023]优选的，所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载特定的脂肪酸而形成的；所述特定的脂肪酸包括棕榈酸和/或硬脂酸、油酸和亚油酸；按照每Immol无脂肪酸白蛋白添加0.l-2mmol的棕榈酸和/或硬脂酸，0.l_2mmol的油酸和0.l_2mmol的亚油酸的比例，将所述特定的脂肪酸添加到所述无脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成。
[0024]优选的，所述特定的脂肪酸还包括花生四烯酸，所述花生四烯酸与所述亚油酸的添加量的比值为1:6?1:1。
[0025]优选的，所述特定的脂肪酸包括棕榈酸和硬脂酸、油酸和亚油酸，所述硬脂酸与所述棕榈酸的添加量的比值为1:6?1:1。
[0026]优选的，所述无血清培养基中，所述白蛋白的添加量为0.015?0.15mmol/L，以基础培养基的体积为基准。
[0027]优选的，所述的白蛋白为牛血清白蛋白、人血白蛋白或重组人血白蛋白。
[0028]优选的，所述的重组白蛋白为水稻胚乳表达的重组人血白蛋白或者转基因酵母菌表达的重组人血白蛋白。
[0029]优选的，所述的基础培养基为IMDM培养基，以基础培养基的体积为基准，所述人转铁蛋白的添加量为I?100mg/L，所述胰岛素的添加量为I?100mg/L，所述胆固醇的添加量为I?10mg/Lo
[0030]优选的，所述血清替代物还包含乙醇胺，其添加量为I?10mg/L，以基础培养基的体积为基准。
[0031]优选的，所述无血清培养基的pH值为6.8?7.5。
[0032]本发明再一方面还提供了上述的配制方法所配制的无血清培养基或者上述的无血清培养基在培养免疫细胞方面的应用。
[0033]优选的，所述的免疫细胞为淋巴细胞或DC细胞。
[0034]优选的，所述的淋巴细胞为T淋巴细胞或NK细胞。
[0035]本发明的无血清培养基配制方法，将脂肪酸负载到无脂肪酸白蛋白上后，再将获得的成分稳定的白蛋白溶液添加到基础培养基中，由此获得的无血清培养基成分更稳定，功能一致性更好，不会因白蛋白的种属来源或加工批次的差异有所不同。
【附图说明】
[0036]图1为实施例1?4的无血清培养基的细胞增殖能力的结果；
[0037]图2为对比例I?4的无血清培养基的细胞增殖能力的结果；
[0038]图3为实施例1?11与对比例5?7的无血清培养基的细胞增殖能力的结果；
[0039]图4为实施例1?11与对比例5?7的无血清培养基的淋巴毒性实验的结果；
[0040]图5为实施例2与对比例5?7的无血清培养基的DC细胞培养计数结果。
【具体实施方式】
[0041]以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些【具体实施方式】。
[0042]实施例1?4
[0043]实施例1?4的无血清培养基的配制过程如下:
[0044]步骤一:获取无脂肪酸白蛋白；
[0045]实施例1取牛血清白蛋白(购自SIGMA公司的A1933产品)1.5mmol，加注射用水配成2000ml溶液，加入50g活性炭，混匀；采用2mol/L的盐酸溶液调pH值到pH3.0 ;置于56°C水浴中30分钟或4°C放置过夜；离心处理(4000转/分钟)去除活性炭；再用2mol/L的NaOH溶液调pH值到pH7.0 ;最后过滤除菌获得实施例1的无脂肪酸白蛋白溶液；
[0046]实施例2取人血白蛋白(购自基立福(Grifols)公司的人血白蛋白(产品规格为20% 50ml*10g/瓶，其中辛酸钠的含量不超过5mol/mol白蛋白))1.5mmol，具体操作过程同实施例1，获得实施例2的无脂肪酸白蛋白溶液；
[0047]实施例3取人血白蛋白(购自武汉生物制品研宄所有限责任公司的人血白蛋白(产品规格20% 50ml*10g/瓶，其中辛酸钠的含量不超过10mol/mol白蛋白))1.5mmol，具体操作过程同实施例1，获得实施例3的无脂肪酸白蛋白溶液；
[0048]实施例4