一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株及其构建方法和 应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 传染性造血器官坏死（Infectious haematopoietic necrosis，IHN)是由弹状病 毒科诺拉弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)感染鲑科鱼类以造血器官出血、坏死为主要病理特征的一种高度传染性和急 性病毒性疾病。IHNV是鱼类弹状病毒的典型代表，危害鱼种类范围很广，有能力感染鲑鱼科 的所有品种。IHNV高致病力毒株对鲑鳟稚鱼的致死率高达100%，感染后幸存的鱼终生带 毒，成为潜在的传染源，并通过粪便和精卵排出病原。目前此病广泛流行于北美、欧洲、亚洲 的各国，已成为世界性鲑鳟鱼病，随着水生动物及其产品进出口贸易的急剧增加，IHN已经 传入我国，并在我国局部地区流行。给鲑鳟养殖业带来重大经济损失。IHNV只有一个血清 型。现今已确定IHNV有4个基因型：U基因型，M基因型，L基因型，JRt基因型。前三种基 因型主要在北美和欧洲流行，JRt基因型在亚洲日本和韩国爆发。IHNV是OIE公布要求上 报的7种鲑鳟病毒性疾病之一，也是口岸鱼类的第一类检疫对象。
[0003] 反向遗传学是针对遗传物质为RNA的生物体而言，在获得生物体基因组全部CDNA 序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，再按基因组组成顺序构建含有生物 体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研宄基因组结构与功能，以及 这些修饰可能对生物体的表型、性状的影响等方面的内容。RNA病毒的反向遗传操作，即构 建RNA病毒的DNA副本，并在DNA水平对病毒基因组进行定向修饰，模拟真实病毒粒子的生 命周期，用以研宄病毒基因结构与功能、病毒与宿主之间相互作用的关系等。RNA病毒突变 率较高，直接对其进行定向操作比较困难。基于DNA水平的反向遗传操作为研宄RNA病毒 的复制及调控机理、病毒毒力、病毒-宿主相互作用和研制新型基因工程疫苗等提供了重 要的技术手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] 重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株的获得：
[0007] 亲本病毒HLJ-09毒株为2009年本实验室从黑龙江省某虹鳟养殖场爆发急性疾病 的死亡的虹鳟组织分离的IHNV。HLJ-09株基因组共包含6种基因，分别编码核衣壳蛋白 (N)，磷蛋白（P)，基质蛋白（M)，糖蛋白（G)，非病毒结构蛋白（NV)和病毒聚合酶（L)。基因 组的顺序为3'-N-P-M-G-NV-L-5'。根据测定的传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基 因序列（Genbank accession no. JX649101)，设计特异性引物，构建两端分别带有锤头状核 酶（HamRz)和丁型肝炎核酶（HdvRz)全长基因组cDNA重组真核表达质粒，以及核蛋白（N)、 磷酸化蛋白（P)、RNA依赖的RNA聚合酶蛋白（L)、非结构蛋白（NV)四个参与病毒转录和复 制的辅助质粒，将上述5个质粒共转染EPC细胞，在细胞RNA聚合酶II的作用下启动真核 表达载体PCI的CMV启动子起始转录各个目的基因，拯救HLJ-09株重组传染性造血器官坏 死病毒（rlHNV)，即为重组病毒rIHNV HLJ-09株。
[0008] 获得的重组传染性造血器官坏死病毒株，命名为rIHNV HLJ-09,分类命名为传染 性造血器官坏死病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北 京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研宄所，微生物保藏号为CGMCC No. 8606,保藏日 期为2013年12月11日。
[0009] 进一步的，本发明提供了一种构建所述的病毒rIHNV HLJ-09株的方法，其特征在 于，采用反向遗传操作系统拯救重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株。
[0010] 在本发明中，优选的，包括以下步骤：
[0011] ⑴根据传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基因序列，设计特异性引物，构 建包括受控于真核启动子的传染性造血器官坏死病毒株HLJ-09的全基因组cDNA序列的转 录质粒；
[0012] (2)根据传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基因序列，设计特异性引物，构 建分别包括编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白（N)的cDNA序列、编码 所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白（P)的cDNA序列、编码所述传染性 造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白（L)的cDNA序列以及编码所述 传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白（NV)的cDNA序列的四个转录辅助质粒， 四个辅助质粒均受控于真核启动子；
[0013] (3)将上述的转录质粒和转录辅助质粒共转染用于病毒拯救的宿主细胞，培养 转染后的宿主细胞，从转染细胞的上清液中拯救重组传染性造血器官坏死病毒株rIHNV HLJ-09。
[0014] 在本发明中，优选的，所述真核启动子为CMV启动子。
[0015] 在本发明中，优选的，步骤（1)中所述转录质粒还包括编码锤头状核酶（HamRz)的 序列、编码丁型肝炎核酶（HdvRz)的序列以及位于全基因组cDNA序列内部的分子标识，所 述全基因组cDNA序列位于真核启动子和编码锤头状核酶（HamRz)的序列之后，编码丁型肝 炎核酶（HdvRz)之前，共同构成转录模板。
[0016] 在本发明中，优选的，所述分子标识是位于全基因组cDNA序列内部的SnaB I酶切 位点以及Spe I酶切位点。
[0017] 在本发明中，优选的，步骤（1)中所述转录质粒为pIHNV-HLJ-09 ;所述传染性造血 器官坏死病毒株HLJ-09的全基因组cDNA序列从5'至3'方向依次分成Fl片段、F2片段、 F3片段、F4片段、F5片段和F6片段6个片段进行扩增，扩增Fl片段的引物的核苷酸序列 为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，扩增F2片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 3和 SEQ ID N0:4所示，扩增F3片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示， 扩增F4片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示，扩增F5片段的引 物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示，扩增F6片段的引物的核苷酸序列 为 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 所示。
[0018] 在本发明中，优选的，步骤（2)中所述四个转录辅助质粒是通过将编码所述传染 性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白（N)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死 病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白（P)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09 株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白（L)的cDNA序列以及编码所述传染性造血器官坏死病 毒HLJ-09株的非结构蛋白（NV)的cDNA序列分别克隆于载体pCI中得到的，分别命名为 pCI-N，pCI-P，pCI-L以及pCI-NV ;扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白 (N)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20所示；扩增所述传 染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白（P)的的cDNA序列的引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA 依赖的RNA聚合酶蛋白（L)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:23-26所示；扩 增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白（NV)的cDNA序列的引物的核苷 酸序列为SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28所示。
[0019] 在本发明中，优选的，步骤（3)中所述转录质粒和四个转录辅助质粒的浓度均为 1 μ g/mL，转录质粒和四个转录辅助质粒的质量比为：pIHNV-HLJ-09 :pCI-N :pCI-P :pCI-L : pCI-NV = 10:5:5:2:1 ;所述宿主细胞为EPC细胞。
[0020] 本发明中应用rIHNV HLJ-09反向遗传系统，将rIHNV HLJ-09的NV ORF用报告基 因 EGFP(绿色荧光蛋白）编码基因替换，成功拯救病毒，重组病毒命名为rlHNV-EGFP。激光 共聚焦显微镜观察该病毒侵染细胞可观察到明显的绿色荧光。说明该rIHNV HLJ-09可应 用于表达外源蛋白。
[0021] 因此，进一步的，本发明还提供了所述的病毒rIHNV HLJ-09株在作为表达外源蛋 白病毒载体中的应用。
[0022] 在本发明中，优选的，利用反向遗传技术在rIHNV HLJ-09病毒基因组内插入外源 基因，表达外源基因蛋白。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0024] 本发明利用采用反向遗传操作系统拯救重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株。拯救的病毒具有特征性的分子标识，通过感染重组病毒的细胞传代实验证明此 病毒能够稳定传代。重组病毒rIHNV HLJ-09腹腔接种虹鳟幼鱼，结果导致幼鱼发病死亡， 致死率可达90%，表明此病毒具有与亲代HLJ-09株病毒相似的致病特性。进一步，本发明 中利用rIHNV HLJ-09反向遗传系统，将rIHNV HLJ-09的NV ORF用报告基因 EGFP (绿色荧 光蛋白）编码基因替换，成功拯救病毒，拯救病毒命名为rlHNV-EGFP。激光共聚焦显微镜观 察rlHNV-EGFP病毒侵染的细胞可观察到明显的绿色荧光，说明该rIHNV HLJ-09病毒株可 应用于表达外源蛋白。
【附图说明】
[0025] 图 1 为全长 cDNA 的 Fl 段-F6 段 PCR产物图，其中，M 为 DL DNA 2000Marker，Fl-F6 为F1-F6段PCR产物；
[0026] 图2为口(：1-1圆￥-!^1-09酶切鉴定结果图，其中，]\1为01^150000嫩1&^1?51'，1为他6 I单酶切