交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒的制作方法

文档序号:9195801阅读:451来源:国知局
交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是中国发明专利申请(申请日:2009年8月10日;【申请号】 200980139886. 5 (国际【申请号】PCT/US2009/053249);发明名称:交叉反应性增强的包含复 合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒)的分案申请。
[0002] 对相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2008年8月8日提交的美国临时申请61/087, 504号和2009年6月 19日提交的美国临时申请61/218, 603号的权益,两者均通过全文提述并入本文。
技术领域
[0004] 本发明属于疫苗领域,特别是包含具有复合氨基酸序列的病毒样颗粒的疫苗,所 述复合氨基酸序列源自代表来自无包膜病毒的两个或更多个衣壳蛋白的共有序列。此外, 本发明涉及制备疫苗组合物的方法和使用本发明的疫苗组合物诱导保护性免疫应答的方 法。
【背景技术】
[0005] 针对具有季节性或年际模式(year-to-year pattern)的病毒的疫苗的流行制备 方法是以商业性流感疫苗为模型的,当病毒演化为呈现不同的抗原性概貌时,需要预测、公 开并随后合成新的疫苗。该方法造成可观的时间延迟和花费,因为新抗原的合成是基于对 下一年病毒株的预测。此外,如2008年流感疫苗的失败所彰显的,在预测的毒株中的失误 可导致可观的疾病相关花费,因为对患者的保护不足。因此,需要改进的方法用于设计并制 备疫苗以针对致病病毒的多种流行株米取保护。
[0006] 诺如病毒(Norovirus)是无法培养的人杯状病毒(Calicivirus),其凸显为非细 菌性胃肠炎流行性爆发的唯一最重要的原因(Glass等(2000) J Infect Dis,Vol. 181 (Sup 2):S254-S261;Hardy 等(1999)Clin Lab Med,Vol.l9(3):675-90)。这些病毒已归为 5 个 不同的基因型组(genogroup),其中基因型组I和II进一步细分为超过25个基因型,且其 为人类中归咎于该病毒的绝大多数疾病的致病体。开发针对诺如病毒的疫苗遭受严峻的考 验,包括无法在培养状态和在合适的急性胃肠炎动物模型中繁殖该病毒。因此,如今无法使 用标准的病毒学技术,包括病毒减毒(varil attenuation)或体外中和分析。
[0007] 诺如病毒含有7. 5Kb单链正义RNA基因组,其含有三个开放阅读框。主要病毒衣 壳蛋白(VPl)由0RF2编码,且该蛋白的表达导致病毒样颗粒(VLP)的自发装配,所述颗粒 模拟病毒的结构,但不能复制。该结构由180个VPl单体亚基组成,且其为预防急性胃肠炎 的候选疫苗。VPl单体具有两个域:外壳(S)域,其形成病毒内部核心,以及由柔性铰链连 接的突起的突出(P)域。P域进一步细分为两个亚域Pl和P2,其为最暴露于表面的区,且 认为其含有重要的细胞识别和抗原性位点。同源性分析表明VPl超可变氨基酸区的大部分 位于 P2 域(AlIen 等(2008) PLoS One, Vol. 1:1-9)。
[0008] 近来的流行病学研宄得出了下述假说:诺如病毒的进化是间断性的(epochal), 其中在停滞期之后出现新的流行性株,这与对流感病毒的观测结果类似。新近的爆发似乎 涉及GII. 4基因型中变体病毒以两年左右的持续间隔出现。在本领域需要下述疫苗候选, 其提供针对多种诺如病毒,或其他无包膜病毒株会有交叉保护性的抗原性表位,这会消除 对于每个现存的爆发株构建疫苗的需要。

【发明内容】

[0009] 本发明部分基于下述发现,即包含复合衣壳序列的多肽(其组合了来自多种流行 病毒株的表位)可用于产生更强烈而稳定的(robust)针对多种病毒株的免疫应答。上述 多肽可用于制备针对病毒的数种流行株提供保护的疫苗制剂,并因此改进对不同菌株和不 同年份的保护。
[0010] 本发明提供了至少一种具有复合氨基酸序列的多肽,其中所述复合氨基酸序列源 自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列,且其中所述至少一种多 肽当在宿主中表达时形成病毒样颗粒,且其如与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列 相比含有至少一个不同的氨基酸。在一个实施方案中,所述包含至少一种复合多肽的病毒 样颗粒具有无包膜病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。在另一个实施方案中,所述复 合多肽或复合病毒样颗粒使得在无包膜病毒的一种或多种流行株的抗血清交叉反应性方 面如与通过用仅含有来自所述一种或多种流行株的蛋白质的病毒样颗粒免疫而获得的抗 血清交叉反应性相比有所增加。
[0011] 所述病毒样颗粒可包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽,所述序列源自代 表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列,其中所述无包膜病毒选自 下组:杯状病毒(Calicivirus)、小 RNA 病毒(Picornavirus)、星状病毒(Astrovirus)、 腺病毒(Adenovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、多瘤病毒(Polyomavirus)、乳头瘤病毒 (Papillomavirus)、细小病毒(Parvovirus)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus)。在一 个实施方案中,所述无包膜病毒是杯状病毒。在另一个实施方案中,所述杯状病毒是诺如病 毒或札幌病毒(sapovirus)。所述诺如病毒可为基因型组I或基因型组II诺如病毒。
[0012] 所述共有序列可源自归类于相同基因型组和基因型的两种或更多种诺如病毒 株。在一个实施方案中,所述共有序列源自基因型组II,基因型4诺如病毒株,如Houston、 Minerva和Laurens株。在另一个实施方案中,所述共有序列源自来自一个基因型组内至少 两个不同的基因型的诺如病毒株。还在另一个实施方案中,所述共有序列源自来自至少两 个不同的基因型组的诺如病毒株。
[0013] 本发明还涵盖包含至少一种源自两种或更多种流行杯状病毒株的复合多肽和来 自第二无包膜病毒(如诺如病毒)的衣壳蛋白的病毒样颗粒。所述衣壳蛋白可为来自基因 型组I或基因型组II诺如病毒的VPl和/或VP2蛋白。在另一个实施方案中,所述病毒样 颗粒包含至少一种源自两种或更多种杯状病毒流行株的复合多肽和源自第二杯状病毒的 两种或更多种流行株的第二复合多肽。优选地,所述病毒样颗粒具有所述第一杯状病毒的 两种或更多种流行株和所述第二杯状病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。
[0014] 本发明还提供了具有复合氨基酸序列的分离的多肽或其片段,其中所述复合氨基 酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列,且其中所述多 肽如与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。所述无 包膜病毒可为杯状病毒,如札幌病毒或诺如病毒。或者,所述无包膜病毒可为乳头瘤病毒。
[0015] 本发明涵盖包含本发明的一种或多种复合多肽或复合病毒样颗粒的疫苗制剂。每 一种复合病毒样颗粒包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽,所述复合氨基酸序列源自 代表来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列。所述无包膜病毒可为 基因型组I或基因型组II诺如病毒。在一些实施方案中,所述疫苗制剂进一步包含佐剂。 在另一个实施方案中,所述疫苗制剂进一步包含递送剂。还在另一个实施方案中,所述疫苗 制剂进一步包含药学上可接受的载体。所述疫苗制剂可为液体制剂或干粉制剂。
[0016] 本发明还提供在受试者中诱导针对病毒感染的保护性免疫的方法,包括向所述受 试者给药本文中公开的疫苗制剂。在一个实施方案中,所述病毒感染是诺如病毒感染。在 另一个实施方案中,所述疫苗制剂赋予针对诺如病毒感染的一种或多种症状的保护。
[0017] 本发明还涵盖制备复合病毒样颗粒的方法。在一个实施方案中,该方法包括比对 来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的氨基酸序列;从所述比对的氨基酸序 列确定共有序列;基于所述共有序列制备复合序列,所述复合序列如与所述两种或更多种 流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸;和在宿主细胞中表达所述复合序 列,由此产生了病毒样颗粒。所述无包膜病毒可为杯状病毒、小RNA病毒、星状病毒、腺病 毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和戊型肝炎病毒。
[0018] 本发明涉及下述各项。
[0019] 1. 一种病毒样颗粒,其包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽,其中所述复合 氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列,且其中所 述至少一种多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒并且与所述两种或更多种流行株 的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。
[0020] 2.项1的病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒具有所述无包膜病毒的两种或更多种 流行株的抗原性质。
[0021] 3.项1的病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒在与所述无包膜病毒的一种或多种流 行株的抗血清交叉反应性方面与通过用仅含有来自所述一种或多种流行株的蛋白质的病 毒样颗粒免疫而获得的抗血清交叉反应性相比增加至少两倍。
[0022] 4.项1的病毒样颗粒,其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株 的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。
[0023] 5.项1的病毒样颗粒,其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株 的衣壳序列相比含有至少5个不同的氨基酸。
[0024] 6.项1的病毒样颗粒,其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株 的衣壳序列相比含有至少9个不同的氨基酸。
[0025] 7.项1的病毒样颗粒,其中所述共有序列是SEQ ID NO:2。
[0026] 8.项1的病毒样颗粒,其中所述无包膜病毒选自下组:杯状病毒(Calicivirus)、 小 RNA 病毒(Picornavirus)、星状病毒(Astrovirus)、腺病毒(Adenovirus)、呼肠孤 病毒(Reovirus)、多瘤病毒(Polyomavirus)、乳头瘤病毒(Papillomavirus)、细小病毒 (Parvovirus)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus)。
[0027] 9.项8的病毒样颗粒,其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
[0028] 10.项9的病毒样颗粒,其中所述杯状病毒是诺如病毒(Norovirus)或札幌病毒 (Sapovirus)〇
[0029] 11.项10的病毒样颗粒,其中所述诺如病毒是基因型组I诺如病毒(genogroup I Norovirus)〇
[0030] 12.项10的病毒样颗粒,其中所述诺如病毒是基因型组II诺如病毒(genogroup II Norovirus) 〇
[0031] 13.项12的病毒样颗粒,其中所述共有序列源自基因型组II,基因型4诺如病毒 株。
[0032] 14.项13的病毒样颗粒,其中所述基因型组II,基因型4诺如病毒株选自Houston 株、Minerva 株和 Laurens 株。
[0033] 15.项14的病毒样颗粒,其中所述复合序列是SEQ ID NO: 1。
[0034] 16.项10的病毒样颗粒,其中所述共有序列源自来自一个基因型组内至少两个不 同的基因型的诺如病毒株。
[0035] 17.项16的病毒样颗粒,其中所述共有序列源自基因型组II,基因型2和基因型 组II,基因型4诺如病毒株。
[0036] 18.项10的病毒样颗粒,其中所述共有序列源自来自至少两个不同的基因型组的 诺如病毒株。
[0037] 19.项18的病毒样颗粒,其中所述共有序列源自基因型组I,基因型1和基因型组 II,基因型4诺如病毒株。
[0038] 20.项10的病毒样颗粒,进一步包含来自第二诺如病毒的衣壳蛋白。
[0039] 21.项20的病毒样颗粒,其中所述第二诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如 病毒。
[0040] 22.项21的病毒样颗粒,其中所述来自第二诺如病毒的衣壳蛋白是来自基因型组 I诺如病毒的VPl蛋白。
[0041] 23.项9的病毒样颗粒,进一步包含具有第二复合氨基酸序列的第二多肽,其中所 述第二复合氨基酸序列源自代表第二杯状病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有 序列,且与第二杯状病毒的所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不 同的氨基酸。
[0042] 24.项23的病毒样颗粒,其中所述复合序列与所述第二杯状病毒的一种或多种流 行株的衣壳序列相比含有5-50个不同的氨基酸。
[0043] 25.项23的病毒样颗粒,其中所述第二杯状病毒是诺如病毒。
[0044] 26.项25的病毒样颗粒,其中所述诺如病毒是基因型组I诺如病毒。
[0045] 27.项26的病毒样颗粒,其中所述基因型组I诺如病毒选自下组:诺沃克病毒 (Norwalk virus)、Southampton 病毒、Hesse 病毒和 Chiba 病毒。
[0046] 28.项23的病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒具有所述第一杯状病毒的两种或更 多种流行株和第二杯状病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。
[0047] 29. -种分离的多肽或其片段,其具有复合氨基酸序列,其中所述复合氨基酸序列 源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列,且其中所述多肽如与 所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。
[0048] 30.项29的分离的多肽,其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行 株的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。
[0049] 31.项29的分离的多肽,其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行 株的衣壳序列相比含有5-50个不同的氨基酸。
[0050] 32.项29的分离的多肽,其中所述共有序列是SEQ ID NO:2。
[0051] 33.项29的分离的多肽,其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
[0052] 34.项33的分尚的多肽,其中所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒。
[0053] 35.项34的分离的多肽,其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病 毒,或其组合。
[0054] 36.项35的分离的多肽,其中所述分离的多肽具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
[0055] 37. -种分离的核酸,其编码SEQ ID NO: 29的多肽。
[0056] 38.项37的分离的核酸,其中所述核酸具有SEQ ID N0:3的序列。
[0057] 39. -种载体,其包含SEQ ID NO: 37的分离的核酸。
[0058] 40. -种宿主细胞,其包含SEQ ID NO:39的载体。
[0059] 41. -种疫苗制剂,其包含项1、项20或项23的病毒样颗粒。
[0060] 42. -种疫苗制剂,其包含项1的病毒样颗粒和第二病毒样颗粒,其中所述第二病 毒样颗粒包含来自诺如病毒的衣壳蛋白。
[0061] 43.项42的疫苗制剂,其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
[0062] 44.项41的疫苗制剂,其进一步包含佐剂。
[0063] 45.项44的疫苗制剂,其中所述佐剂选自下组:toll样受体(TLR)激动剂、单磷 酰基脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽 (MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、蜗状佐剂 (cochleate)、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(poly(lactide-co-glycolides) (PLG))微粒、 泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、水包油乳剂、MF59和鲨烯。
[0064] 46.项44的疫苗制剂,其进一步包含递送剂。
[0065] 47.项46的疫苗制剂,其中所述递送剂是粘膜粘着剂。
[0066] 48.项47的疫苗制剂,其中所述粘膜粘着剂选自下组:糖胺聚糖(例如硫酸软骨 素、硫酸皮肤素软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸(hyaluronan))、糖聚 合物(例如果胶、藻酸盐、糖原、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、壳多糖、水苏糖、unulin、糊精、 葡聚糖)、聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(包括粘蛋白、其 他粘多糖和GeISite' 一种从芦荟植物提取的天然酸性多糖)、聚离子化合物(polyion)、 纤维素衍生物(例如,羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素)、蛋白质(例如凝集素、菌毛蛋白 (fimbrial protein))和脱氧核糖核酸。
[0067] 49.项48的疫苗制剂,其中所述粘膜粘着剂是多糖。
[0068] 50.项49的疫苗制剂,其中所述多糖是壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖碱。
[0069] 51.项44的疫苗制剂,其中所述疫苗制剂是液体制剂。
[0070] 52.项44的疫苗制剂,其中所述疫苗制剂是干粉制剂。
[0071] 53.项52的干粉制剂,其与一种或多种用于给药一剂或多剂所述制剂的装置组 合。
[0072] 54.项53的干粉制剂,其中所述一剂或多剂为单位剂量。
[0073] 55.项53的干粉制剂,其中所述装置为一次性鼻给药装置。
[0074] 56.项41的疫苗制剂,其中所述制剂通过选自下组的途径向受试者给药:粘膜、肌 肉内、静脉内、表皮下、真皮内、真皮下和经皮给药途径。
[0075] 57.项56的疫苗制剂,其中所述粘膜给药是鼻内、经口或阴道给药。
[0076] 58.项57的疫苗制剂,其中所述制剂为鼻喷雾剂、滴鼻剂或干粉的形式。
[0077] 59. -种疫苗制剂,其包含项39的载体。
[0078] 60. -种在受试者中诱导针对病毒感染的保护性免疫的方法,包括向所述受试者 给药项41的疫苗制剂。
[0079] 61.项60的方法,其中所述病毒感染是诺如病毒感染。
[0080] 62.项61的方法,其中所述疫苗制剂赋予针对诺如病毒感染的一种或多种症状的 保护。
[0081] 63. -种制备病毒样颗粒的方法,包括在宿主细胞中表达项29的多肽;使所述细 胞在形成病毒样颗粒的条件下生长;和分离所述病毒样颗粒。
[0082] 64.项63的方法,其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
[0083] 65.项64的方法,其中所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒。
[0084] 66.项65的方法,其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
[0085] 67.项66的方法,其中所述多肽具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
[0086] 68.项63的方法,其中所述共有序列是SEQ ID NO:2。
[0087] 69. -种制备病毒样颗粒的方法,包括:
[0088] 比对来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣
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