I型胶原蛋白高亲和力多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽领域，具体涉及I型胶原蛋白高亲和力多肽，还涉及该多肽在制 备纤维化成像剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 纤维化是人体组织器官重要的、典型的病理过程之一。它主要表现为组织内实质 细胞减少纤维结缔组织增多，可发生在几乎全身任何组织，能够导致器官结构破坏和功能 减退。如果得不到有效的控制，最终将导致器官功能衰竭，甚至死亡。纤维化与多种疾病密 切相关，主要包括：（1)心血管病：如动脉硬化、充血性心力衰竭；（2)肺病：如特发性肺纤 维化、慢性阻塞性肺病；(3)肝病：各种类型的肝炎或肝损伤导致的肝硬化；(4)肾病：如慢 性肾小球肾炎、糖尿病肾病、狼疮性肾病等；（5)眼病：如糖尿病视网膜病变和老年黄斑变 性；(6)皮肤肌肉疾病：如硬皮病、皮肌炎等。因此，对纤维化的诊断、进展监测、疗效评估显 得非常重要，是临床非常关注的问题。
[0003] 穿刺活检是纤维化检测和定性的金标准，但作为一种侵入性有创检查，不宜反复 进行。超声、CT和MRI等传统影像学检查方法主要依靠形态学改变做出诊断，但纤维化病 变早期往往缺乏形态学异常。放射性核素显像也是检查纤维化病变的重要手段之一。近 年，已有多种放射性核素标记药物用于纤维化显像的实验和临床研宄，如 18F-FDG葡萄糖代 谢显像，18F-脯氨酸显像，68Ga-生长抑素类似物显像以及 18F-FBEM标记的白细胞显像等。这 些显像方式可用于评估纤维化病变的活动性与预后，为其鉴别诊断提供依据。但是，上述显 像方法不具特异性，不是直接显示纤维化病变，而是显示纤维化发展过程中某些阶段的间 接征象，只能作为一种补充检查手段。因此，目前临床上缺少一种可靠的纤维化显像方式。
[0004] 研制能够显示纤维化特征性病理改变的新型分子显像剂可能是解决上述问题的 有效途径。纤维化的主要病理特点是细胞外基质中胶原蛋白的大量堆积，而且胶原蛋白堆 积量与纤维化的严重程度呈正相关。因此，胶原蛋白可作为纤维化显像的理想靶标。靶向 胶原蛋白的多肽分子，因分子量小，血管穿透性好，血浆清除速度快，较抗体或受体等大分 子更适合作为体内示踪剂。Muzard筛选出能够与I型胶原蛋白结合的血小板胶原蛋白受体 糖蛋白IV模拟肽，但用 99mTc标记的该多肽显像剂在正常肝脏组织有高度摄取，不利于在体 显示肝纤维化病变。因此，急需一种能够在体显示肝纤维化病变的多肽显像剂，并能用于纤 维化的诊断、监测及疗效评估。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供I型胶原蛋白高亲和力多肽；本发明的目 的之二在于提供含有所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物；本发明的目的之三在于提 供I型胶原蛋白高亲和力多肽的应用；本发明的目的之四在于提供I型胶原蛋白高亲和力 多肽的衍生物的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 1、I型胶原蛋白高亲和力多肽，所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0008] 2、含有权利要求1所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物，所述衍生物为I型 胶原蛋白高亲和力多肽的氨基端修饰生物素。
[0009] 或在I型胶原蛋白高亲和力多肽的羧基端通过间隔γ_氨基丁酸连接的能够螯合 99mTc的氨基酸序列。
[0010] 优选的，所述能够螯合99niTc的氨基酸序列为甘氨酸-右旋丙氨酸-甘氨酸-甘氨 酸构成的4氨基序列。
[0011] 3、所述I型胶原蛋白高亲和力多肽在制备纤维化成像剂中的应用。
[0012] 4、权利要求3或4所述的I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物在制备纤维化成像 剂中的应用。
[0013] 本发明的有益效果在于：本发明公开了 I型胶原蛋白高亲和力多肽，多肽序列为 Cys Pro Lys Glu Ser Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp (以下简称CBP1495)，CBP1495 为 基质金属蛋白酶-2前体中的片段，其内含有基质金属蛋白酶-14的识别位点。在对CBP1495 的研宄发现，该多肽能够与I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟（GPO) 9以较高亲和力结合。能够 用于Western Blot、ELISA及组织化学等体外示踪胶原蛋白，还能以非侵袭性在体显示纤维 化病变，有望用于纤维化的诊断、监测及疗效评估；并且CBP1495多肽可以用核素标记，在 体内血浆清除速度快，软组织本底低，有利于减少受检者接受的辐射剂量。
【附图说明】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0015] 图1为ITC分析结果（A. lmmol/L CBP1495滴定4 ymol/L I型胶原蛋白； B. 0· 8mmol/L CBP1495 滴定 0· lmmol/L(GP0)9;C. lmmol/L RP1584 滴定 4 ymol/L I 型胶原 蛋白；D. 300 μ mol/LCBP1495 滴定 20 μ mol/L BSA)。
[0016] 图2为CBP1495与I型胶原蛋白的结合能力分析结果（Α·考马斯亮蓝染色、 Biotin-CBP1495及Biotin-RP1584的Western Blot分析对I型胶原蛋白溶液的检测；B.不 同浓度Biotin-CBP1495及Biotin-RP1584对I型胶原蛋白的ELISA分析；C.大鼠尾皮肤 及小鼠肌腱的HE、Masson染色及Biotin-CBP1495和Biotin-RP1584的组织化学染色（放 大倍数X 100);注：Biotin-RP1584为阴性对照；##P〈0. 0001，NS没有统计学差异）。
[0017] 图 3 为 99niTc-CBP1495 理化性质鉴定（A.99niTc-CBP1495 室温下放置 0、1、2、4、 8h的RCP ;B.三氯乙酸蛋白沉淀实验结果；C.未标记多肽CBP1495gagg的HPLC分析； D. 99niTc-CBP1495 经 HPLC 后的洗脱液 T-A 曲线）。
[0018] 图4为99niTc-CBP1495在正常实验动物体内的示踪和分布（A. 99niTc-CBP1495示踪动 力学实验中实测值T-A曲线与拟合值T-A曲线；B.静脉注射37MBq" mTc-CBP1495后Ih大 耳兔前位静态显像；C.静脉注射37MBq99mTc-CBP1495后，大耳兔前位动态显像（5min/帧， 60min) ;D.静脉注射7. 4MBq"mTc-CBP1495后，健康小鼠体内主要脏器不同时间对标记多肽 的摄取分布）。
[0019] 图5为肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠（正常对照）的肺、肝组织HE、 Masson染色结果（放大倍数X 100) 〇
[0020] 图6为纤维化大鼠99niTc-CBP1495显像（A.静脉注射99niTc-CBP1495后l、2、4h肺纤 维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠（正常对照）平面显像；B.静脉注射" mTc-CBP1495后 2h肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠断层显像）。
[0021] 图7为对"mTc-CBP1495摄取的评估（A.肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠 的肺、肝组织羟脯氨酸含量（Hyp，yg/g) ;B.静脉注射"mTc-CBP1495后2h，肺纤维化、肝纤 维化大鼠模型及健康大鼠的肺、肝组织对标记多肽的摄取（ID%/g) ;C.肺组织Hyp含量与 标记多肽摄取量（2h)的线性相关性分析；D.肝组织Hyp含量与标记多肽摄取量（2h)的线 性相关性分析；注：#**P〈〇. 0001)。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0023] 实施例1、多肽的合成
[0024] 根据I型胶原蛋白结构，利用软件设计高亲和力多肽，具体序列为： CPKESCNLFVLKD (以下简称CBP1495)，该多肽是基质金属蛋白酶-2前体中的片段，其内含有 基质金属蛋白酶-14的识别位点。为了能够使CBP1495显色，在CBP1495的氨基酸用生物 素标记，并在生物素多肽之间加入了 3个甘氨酸作为间隔。此外，在CBP1495的羧基端连接 了能够螯合99mTc的4氨基酸序列（-G-(D)A-G-G)和作为间隔的γ-氨基丁酸（Aba)。同时 设计随机十三肽RP1584作为阴性对照，并设计胶原蛋白模拟肽（GPO) 9，具体序列如表1所 示。（GPO)iJg够在溶液中自发形成类似胶原蛋白的三螺旋结构。然后委托上海强耀生物技 术有限公司固相法合成如表1所示的多肽，将合成的多肽经高效液相色谱法（HPLC)纯化， 并通过质谱鉴定，结果显示纯化后的多肽纯度均>95%。
[0025] 表1、合成的多肽
[0026]
[0027] 注：Aba代表γ -氨基丁酸；(D) A代表右旋丙氨酸；0代表羟脯氨酸；
[0028] 实施例2、CBP1495与I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟肽（GPO)9的亲和力分析
[0029] 亲和力分析使用通过等温滴定量热法（isoth