以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法

以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及益生菌微胶囊制备方法，具体涉及以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益 生菌微胶囊的方法。
【背景技术】
[0002] 益生菌常因高强度的生产加工而大量失活，常规添加手段不能保护益生菌免受喂 饲过程的胃酸、胆盐以及消化酶等的作用，导致活菌数大幅下降，因此很难有足够数量的活 菌到达肠道并定居于肠黏膜上而发挥其生理功能。包埋是提高益生菌活性的一种有效方 法。研宄发现微胶囊包埋技术是最好方法之一，并成为目前国内外研宄的热点。
[0003] 微胶囊技术是一种用成膜材料（即壁材）把某种物质（即芯材）包覆并使之形成微 小粒子的技术，得到的微小粒子叫做微胶囊，其粒径一般在微米到毫米范围。微胶囊技术最 大的特点是芯材可根据需要在恰当的时间和位置以一定的速率进行释放。采用肠溶性壁材 后，能防止胃液的破坏，而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的作用。益生 菌微胶囊化常用的方法是挤压法、乳化法、喷雾干燥法、复凝聚法和淀粉粘附法等。
[0004] 微胶囊包埋存在的问题除了制备方法外，壁材的选用成为关键，目前一般选用如 海藻酸钠、明胶等有机高分子材料。凹凸棒石粘土简称凹土，是一种天然非金属粘土矿物， 具有较好吸附性、胶体性、粘结性、催化性等。凹土富含生物活性物质，可作为益生菌载体制 备益生菌制剂。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于：提供一种以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方 法，以海藻酸钠、明胶复合凹土作为壁材，既发挥靶向性和控释性方面的优异性能，又提高 其机械强度，该胶囊提高益生菌制备过程中的存活率以及经过胃环境到达肠的存活率。
[0006] 本发明的技术解决方案是：该方法首先是纯化凹土，其次将凹土与海藻酸钠、明胶 混合成复合壁材，接着将已制备好的益生菌菌悬液在一定的条件下与上述复合壁材混合均 匀，然后缓慢滴入CaCl 2中固化成型，最后真空冷冻法干燥，获得益生菌微胶囊。
[0007] 本发明的制备方法包括以下具体步骤： 第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5 μ s/cm的去离子水浸泡20~28h，搅拌器 以1000~1500rpm转速搅拌20~28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其5~20%的量继续加 入上述去离子水，同样操作，重复2~3次，于105~120°C烘干，研磨，过筛，取200目至140目 细土备用； 第二步益生菌菌悬液的制备：将枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保 加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪链球菌、地衣芽孢杆菌或酵母菌培养至对数生长期后期， 收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于PH为2~9的磷酸盐缓冲体系中， 并将浓度调节至l〇 9~l〇lclCFU/ml备用； 第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将5-50g的海藻酸钠、0-50g的明胶和l-40g的 凹土悬浮至IOL的菌悬液中，混合均匀； 第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为 0. 01-2mol/L、pH5-8磷酸盐缓冲液配制的浓度为l-50g/L的CaCl2*，于20-40°C固化成型 10-100分钟，获得粒径大小为100-2000 μ m的微胶囊粒子； 第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊 粒子于-40~-75°C预冻2~3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20~28小时，使微囊制剂含 水量< 2%，检测活菌剂中活菌数为109~1012CFU/g。
[0008] 枯草芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g， 蒸馏水1000ml，ρΗ7· 2 ;35°C振荡培养18h，摇床转速为180rpm。
[0009] 双歧杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g， NaCl 5g，Na2HPO4 2. 5g，蒸馏水 1000ml，pH7 ;35°C静置培养 22 小时。
[0010] 嗜酸乳杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢 二铵 2g，葡萄糖 20g，吐温-80 lml，CH3COONaCH2O 5g，K2HP04*3H20 2g，MgSO4WH2O 0.58g， MnSCVH2O 0· 25g，蒸馏水 1000ml，调 ρΗ6· 2-6. 4 ;37°C静置培养 20 小时。
[0011] 嗜热链球菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；40°C静置培养20小时。
[0012] 保加利亚乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37°C静置培养20小时。
[0013] 鼠李糖乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌；37°C静置培养20小时。
[0014] 粪链球菌培养条件是：培养基为蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml， pH6. 8 ;37°C振荡培养6h，摇床转速为lOOrpm。
[0015] 地衣芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g， 蒸馏水1000ml，pH 7· 0 ;37°C振荡培养40h，摇床转速为180rpm。
[0016] 酵母菌培养条件是：培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然； 28°C振荡培养18h，摇床转速为150rpm。
[0017] 本发明的优点是：采用海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊，和单纯凹土制 得的活菌制剂在真空冷冻过程中和在人工模拟胃环境中的存活率要高得多，在人工肠环境 中能较长时间地维持高活菌水平。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为 是对技术方案的限制。
[0019] 实施例1 :依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂 第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5 μ s/cm的去离子水浸泡20h，搅拌器以 1000 rpm转速搅拌20h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其5%的量继续加入上述去离子水， 同样操作，重复2次，于105°C烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用； 第二步益生菌菌悬液的制备：将枯草芽孢杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用 无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为2的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至 IO9CFUAiI备用；枯草芽孢杆菌培养条件是：培养基为葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7. 2 ;35°C振荡培养18h，摇床转速为180rpm ; 第三步壁材与益生菌混合溶液的制备：将5g海藻酸钠和Ig的凹土悬浮至10L的菌悬 液中，混合均匀； 第四步微胶囊固化成型：将上述壁材与益生菌的混合溶液缓慢滴加入离子强度为 0. 01mol/L、pH5磷酸盐缓冲液配制的浓度为lg/L的CaCl#，于20°C固化成型10分钟，获 得粒径大小为100 μ m大小的微胶囊粒子； 第五步真空冷冻干燥法获得益生菌微胶囊制剂：真空冷冻干燥法条件为：上述微胶囊 粒子于-40°C预冻3小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20小时，使微囊制剂含水量< 2%， 检测活菌剂中活菌数为l〇9CFU/g。
[0020] 实施例2 :依以下步骤制备益生菌微胶囊制剂 第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5 μ s/cm的去离子水浸泡21h，搅拌器以 IlOOrpm转速搅拌21h，静置分层，取中间层凹土悬液，以其10%的量继续加入上述去离子 水，同样操作，重复3次，于110°C烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土备用； 第二步益生菌菌悬液的制备：将双歧杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无 菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为3的磷酸盐缓冲体系中，并将浓度调节至 101(lCFU/ml备用；双歧杆菌培养条件是：培养基为蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉 膏 4g，NaCl 5g，Na2HPO4 2. 5g，蒸馏水 1000ml，pH7 ;35°C静置培养 22