氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法

文档序号:9195821
氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于制备固定化酶领域,具体涉及一种氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002]漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶广泛分布于真菌分泌物、高等植物、少量细菌和昆虫中。按其来源漆酶主要分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。漆酶分子一般含有4个铜离子,在漆酶催化反应的过程中,4个铜离子在酶与底物间进行电子传递,从而氧化底物为自由基,随后自由基通过漆酶进一步催化氧化或非酶催化反应生成各种产物。作为一种特殊的氧化还原酶类,漆酶能利用氧气催化氧化多种酚类和芳香胺类化合物,底物范围相当广阔。因此漆酶在废水处理、食品加工、芳香化合物转化、生物医药以及传感器研制等方面具有重要的应用价值。但游离漆酶在使用过程中易随环境的变化而变性失活,且不易从反应体系中分离,这在一定程度上限制了漆酶的工业化应用。
[0003]然而固定化漆酶可在一定程度上提高酶的热稳定性、有机溶剂耐受性和极端环境稳定性,同时还具有可重复使用和易于从反应体系中分离出来的特点。对固定化漆酶的研宄和应用是实现漆酶工业化应用的有效手段。按漆酶和载体结合的方式来分,漆酶的固定化方法主要分为两类:物理方法(物理吸附法和包埋发)和化学方法(离子吸附法、共价结合法和交联法)。不过,虽然已经报道了大量漆酶固定化的研宄工作,但仍然存在各种各样的不足,到目前为止,还没有一种固定化漆酶能实际应用于工业生产。另一方面,由于漆酶的氧化还原电位较低,导致其底物范围较窄,为了克服这一问题,人们以TEMPO、HBT等小分子物质作为介体开发构建了高效的漆酶-介体系统,以拓展漆酶的应用范围。但随之而来的问题是小分子介体尽管添加量少,但由于价格普遍比较高、且无法回收利用,因而也无法推动漆酶的规模化工业应用。
[0004]将磁性纳米材料应用于酶的固定化已经成为研宄的热点。由于磁性纳米载体材料本身具备的磁响应和粒子表面积大、粒径小的特点,给固定化酶带来了优势,如易分离、不易被反应环境中的酸碱等腐蚀、稳定性强、回收率高、成本低等。目前为止,固定化漆酶和固定化介体均有相关的研宄报道,但还没有发现共价交联共固定化漆酶与介体的报道。因此,本发明拟通过对磁性纳米粒子Fe3O4进行氨基修饰,并共价交联同时固定漆酶和TEMPO介体。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法,用于解决游离漆酶和TEMPO介体使用效率低,不易分离和不能重复利用的问题。
[0006]为了实现上述目的,本发明采用的技术手段为:
一种氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统,该系统是将漆酶和介体共同固定化在氨基硅烷化磁性纳米粒子上,每Ig共固定化漆酶和介体系统中固定有0.2-0.5mmol介体,固定化后的漆酶酶活为80-200U/g。
[0007]所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法,包括如下步骤:
I)Fe304磁性纳米粒子的制备:将FeCl 2和FeCl 3混合,在N2保护、搅拌、70° C水浴的条件下,加入NaOH溶液,并持续搅拌1-2 h后,将黑色产物分离出来,去离子水洗至中性,得到Fe3O4磁性纳米粒子,然后将Fe3O4磁性纳米粒子置于7 (wt)%的四甲基氢氧化铵(TMAOH)水溶液中静置2 h,用水洗涤3-5次备用;
2)Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES):将步骤I)制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子置于乙醇水溶液中,然后加入APTES,50°C,搅拌反应10h,反应产物用去离子水清洗3-5次后,真空干燥,得到表面氨基硅烷化磁性纳米粒子;
3)介体的固定化:取步骤2)得到的氨基硅烷化磁性纳米粒子置于戊二醛溶液中静置2h,去离子水洗数次以除去多余的戊二醛,加入4-NH2-TEMP0,室温下震荡反应4h,反应结束后,分离出产物,水洗,得到接枝了介体的纳米粒子;
4)漆酶的固定:将漆酶加入50mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲中,再加入接枝了介体的纳米粒子,35° C震荡反应4h后,再以50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次,以洗去未固定的酶,得到氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统。
[0008]步骤I)中 FeCljPFeCl 3的摩尔比为 1:2-2:3。
[0009]步骤I)中NaOH溶液浓度为3 mol/Lo
[0010]步骤2)中每I g制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子置于100-200 mL乙醇水溶液中,然后加入1-3 mL APTESo
[0011]步骤2)中乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为1:1。
[0012]步骤3)中戊二醛溶液的质量浓度为2%。
[0013]步骤3)中每Ig氨基硅烷化磁性纳米粒子加入1-3 mmol的4_ΝΗ2_ΤΕΜΡ0。
[0014]步骤4)中Ig接枝了介体的纳米粒子与200 U的漆酶进行交联固定。
[0015]有益效果:
本发明首次将漆酶与介体共固定于磁性载体上,运用磁纳米技术制备氨基硅烷化磁性纳米粒子载体,制备工艺简单、成本低廉,并同时共价交联漆酶和TEMPO介体,构建了高效的漆酶-介体催化系统,共固定化的漆酶-介体系统可以通过外部磁场简便回收,反复使用,从而提高酶和介体的利用率,降低生产成本。
【附图说明】
[0016]图1氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统10次的连续降解脱色结果图。
【具体实施方式】
[0017]本实施例中所使用的漆酶购于SIGMA公司,所使用的4-NH2-TEMP0购于梯希爱化成工业发展有限公司。
[0018]实施例1
氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法,包括如下步骤:
(OFe3O4磁性纳米粒子的制备:将0.02 mo I FeCl 2和0.04 mo I FeCl 3溶于10mL去离子水中,在队保护坏境、机械搅拌、70° C水浴的条件下加入3 mo I/L的NaOH溶液250mL,滴加完毕后持续搅拌I h。在外加磁场的作用下将黑色产物分离出来,并用去离子水清洗直至产物为中性,将得到的Fe3O4磁性纳米粒子置于7 % (质量百分比)的四甲基氢氧化铵(TMAOH)水溶液中静置2 h,用水洗涤3-5次备用。
[0019](2)Fe304磁性纳米粒子表面修饰APTES -M I g制备得到的Fe 304磁性纳米粒子置于150 mL乙醇水溶液(体积比1:1)中,然后加入2 mL APTES,50°C,搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5次后,真空干燥,得到表面氨基硅烷化磁性纳米粒子。
[0020](3)介体的固定化:取I g制备得到的氨基硅烷化磁性纳米粒子置于质量浓度为2%的戊二醛溶液中静置2h,去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入2 mmol4-NH2-TEMP0,室温下震荡反应4h,反应结束后,分离出产物,水洗,得到接枝了介体的纳米粒子。
[0021](4)漆酶的固定:取20 U漆酶加10 mL50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲中,再加入100 mg接枝了介体的纳米粒子,35° C震荡反应4h后,50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次,以洗去未固定的酶,置于4°C冰箱备用,得到氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统(即漆酶与介体共固定化的磁性纳米粒子)。每Ig共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子中固定有0.4mmol介体,固定化后的漆酶酶活为120 U/g。
[0022]考察上述磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统在降解染料废水中的应用效果,选取酸性品红染料,250mL锥形瓶中加入500 mg/L的酸性品红染料5mL、10mg上述制备的共固定化磁性纳米粒子和95 mL 50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲,总反应体系为100mL。40°C下置于10rpm恒温震荡仪中反应,间隔2 h测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率= (1-AAtl) *100%,Atl为脱色反应前溶液吸光值,A为脱色反应后溶液吸光值,所有脱色反应均重复3次取平均,计算脱色率达84.55%。而在没有TEMPO的参与下,仅加入同等酶活力的游离漆酶,脱色率仅有2.3%。
[0023]实施例2
氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法,包括如下步骤:
(OFe3O4磁性纳米粒子的制备:将0.02 mo I FeCl 2和0.04 mo I FeCl 3溶于10mL去离子水中,在队保护坏境、机械搅拌、70° C水浴的条件下加入3 mo I/L的NaOH溶液250mL,滴加完毕后持续搅拌I h。在外加磁场的作用下将黑色产物分离出来,并用去离子水清洗直至产物为中性,将得到的Fe3O4纳米粒子置于7(wt) %的四甲基氢氧化铵(TMAOH)水溶液中静置2 h,用水洗涤3-5次备用。
[0024](2) Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰APTES:?.1 g制备得到的Fe 304磁性纳米粒子置于150 mL乙醇水溶液(乙醇水溶液中乙醇与水的体积比1:1)中,然后加入2 mL APTES,50°C,搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5次后,真空干燥,得到表面氨基硅烷化磁性纳米粒子。
[0025](3)介体的固定化:取I g制备得到的氨基硅烷化磁性纳米粒子置于质量浓度为2%的戊二醛溶液中静置2h,去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入I mmol4-NH2-TEMP0,室温下震荡反应4h,反应结束后,分离出产物,水洗,得到接枝了介体的纳米粒子。
[0026](4)漆酶的固定:取25 U漆酶加10 mL 50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲中,再加入100 mg接枝了介体的纳米粒子,35° C震荡反应4h后,50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次,以洗去未固定的酶,置于4°C冰箱备用,得到漆酶与介体共固定化的磁性纳米粒子,即氨基娃烧化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统。每Ig共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子中固定有0.22mmol介体,固定化后的漆酶酶活为1
再多了解一些
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1