一种细菌dna提取液、提取方法及其应用
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌DNA提取液、提取方法及其应用，特别涉 及一种能从多种细菌及其混合物中提取核酸的细菌DNA提取液、提取方法及其应用。
【背景技术】
[0003] 近年来在感染性疾病中不同种类细菌的多重感染趋于增加，多重感染严格地说， 指多种细菌均是作为原发性的且是同时发生的感染。多重感染性疾病在临床上相当常见， 但由于病因复杂所以确诊甚为困难。
[0004] 随着分子诊断技术的发展，使聚合酶链式反应（PCR)和探针杂交等分子生物学方 法以非培养方式直接检测细菌样品成为可能。分子诊断技术的第一步就是模板核酸的制 备，即样品中核酸的提取，这直接影响着检测的结果。
[0005] 长期以来，样品中核酸的提取和纯化一直是耗时，繁琐的过程，虽然目前细菌的核 酸提取方法和商品化的试剂盒有很多，并且这些方法的原理和操作过程各不相同，但是没 有一个公认的可以同时对多种细菌混合物进行核酸进行高效提取的方法。因此，如何从多 种细菌混合物中高效、快捷的提取核酸进行检测已成为了目前分子诊断技术推广和应用的 瓶颈。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种能从多种细菌混合物 中提取核酸的细菌DNA提取液，同时提供用该提取液提取细菌核酸的方法。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现： 一种细菌DNA提取液，由3_[(3_胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、氢氧化 钠和水组成，所述3_[(3_胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸在提取液中浓度为 0. 00001-0. 0002mg/mL，所述NP-40在提取液中体积百分含量为001-0. 02%，所述氢氧化钠 在提取液中的浓度为〇· 01 -〇· 〇5mg/mL，提取液pH值为8. 0-8. 8。
[0008] 本发明进一步优选方案是，所述3- [ (3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸 在提取液中的浓度为〇. 〇〇〇lmg/mL，所述NP-40在提取液中体积百分含量为0. 01%，所述氢 氧化钠在提取液中的浓度为0. 03mg/mL，提取液pH值为8. 3。
[0009] 用上述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法，包括如下步骤：将1000-3000 μ 1 细菌混合液置于离心管中，在15_37°C条件下，10000-15000rpm离心5-10min，弃上清，在沉 淀物质中加入细菌DNA提取液10-100 μ 1，反应I-IOmin后，剧烈振荡2min，然后瞬时离心， 去除管壁液体，得到细菌混合物的核酸。
[0010] 本发明进一步优选方案是，将3000μ 1细菌液置于离心管中，在25°C条件下， 12000rpm离心10min，弃上清，在沉淀物质中加入细菌DNA提取液50 μ 1，反应3min后，剧烈 振荡2min，然后瞬时离心，去除管壁液体，得到细菌混合物的核酸。
[0011] 所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。进一步，所述细菌为沙门氏菌、志 贺氏菌、金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌。
[0012] 上述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法应用于PCR检测。
[0013] 本发明细菌DNA提取液及其提取方法能够同时从革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细 菌混合样品中提取核酸，操作简单，成本低，提取效果好，提取的核酸能够应用于分子诊断 领域。
【附图说明】
[0014] 图1为沙门氏菌核酸的实时荧光定量PCR检测（曲线1是本发明所述方法所提取 的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线2水煮法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR 结果是)。
[0015] 图2为志贺氏菌核酸的实时荧光定量PCR检测（曲线3是本发明所述方法所提取 的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线4是水煮法所提取的核酸产物的实时荧光定量 PCR结果)。
[0016] 图3为金黄色葡萄球菌核酸的实时荧光定量PCR检测（曲线5是本发明所述方法 所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线6是水煮法所提取的核酸产物的实时荧 光定量PCR结果)。
[0017] 图4为溶血性链球菌核酸的实时荧光定量PCR检测（曲线7是本发明所述方法所 提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线8是水煮法所提取的核酸产物的实时荧光 定量PCR结果)。
【具体实施方式】
[0018] 为了便于理解本发明，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应 当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，下述实施例 中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特 殊说明，均可从商业途径得到。
[0019] 实施例一 一种细菌DNA提取液，由3-[ (3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、氢氧化钠 和水组成，所述3-[(3_胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸在所述提取液中的浓度为 0. 00001-0. 0002mg/mL，所述NP-40在所述提取液中的浓度为0. 001-0. 02%(体积百分含量)， 所述氢氧化钠在提取液中的浓度为〇. 01 -〇. 〇5mg/mL，提取液pH值为8. 0-8. 8。
[0020] 在本实施例中，所述3_[(3_胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸在所述提取 液中的浓度为〇.〇〇〇lmg/ml，所述NP-40在所述提取液中的浓度为0. 01% (体积百分含 量)，所述氢氧化钠在提取液中的浓度为〇. 〇3mg/mL，提取液pH值为8. 3。
[0021] 实施例二 用实施例一所述的细菌DNA提取液提取沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血 性链球菌核酸，同时用现有技术即水煮法裂解上述细菌，并用实时荧光PCR检测进行对比。
[0022] 1、实验材料 细菌样本：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌混合物。
[0023] 试剂：细菌DNA提取液、DEPC水、灭菌水。
[0024] 引物：
2、细菌核酸的提取 (1)制备细菌混合样本： 分别将沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌(均购买自武汉菌种保存 中心)接种于ImL的LB培养基，培养条件为37°C过夜培养，然后将其混合，得到4mL的细菌 混合样本。
[0025] (2 )本发明细菌混合样本DNA的提取： 取ImL的细菌混合样本，1200