拟南芥抗逆相关基因AtPED2及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种增强植物对干旱抗性的 AtPED2基因，同时还涉及一种拟南芥抗逆相关基因 AtPED2的制备方法，以及该基因在增强 植物对干旱抗性中的用途。
【背景技术】
[0002] 每一个生命过程都是自身信息和环境信息结合的过程，不断变化的外界环境使植 物处于非理想的生活状态，这种不利于植物生长和发育的环境条件总称为胁迫，既包括病 害、虫害等造成的生物胁迫，也包括诸如极温（高温、冷害和冻害等）、盐渍、干旱、水涝、UV 辐射、有害气体和除草剂等许多种理化因子给植物带来的非生物胁迫。植物生长发育过程 中会遭遇各种生物胁迫和非生物胁迫的伤害，这些胁迫会影响植物的整个生长发育过程， 也会影响各种农作物产量，对农业生产造成很大的危害。非生物胁迫对植物的损害主要包 括导致植物细胞膜系统的损害、造成各种代谢的紊乱，并造成活性氧的爆发和各种离子毒 害。
[0003] 在全球气候（温度升高和降水格局）变化条件下，各种环境胁迫单独或联合的作 用将导致作物大幅度减产，并引发自然生态系统退化。尤其是，干旱对世界作物产量的影 响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害总和，已成为制约农业发展的一个重 要问题。在我国约有1/3的土地处于干旱区，尤其是北方干旱半干旱地区，而南方也会因雨 量时空分布不均而经常发生季节性干旱。植物一般是生长于土壤中的，不能够自由移动，所 以在长期的自然选择中进化出了一系列的反应机制来适应或抵抗胁迫的伤害。研宄植物耐 干旱机制，从而提供提高植物耐旱的各种措施或直接培育耐旱品种，显然意义重大。
[0004] 非生物胁迫（包括干旱、盐和冷害等）是植物生活史中不可避免的不利因素，这些 逆境胁迫因子单独或者共同作用从而制约着农作物的生产。然而，植物由于自身不能移动， 当遭受逆境环境时只能应答外界胁迫，从而进化出一系列复杂而精密的调控机制，来感受 外部胁迫并传递信号，最终在分子、细胞和整个植株水平形成应激性反应。各种逆境胁迫首 先被植物细胞膜上的感应器所感受，然后信号被传导到下游并且造成第二信使的产生，进 而引起下游的一系列生理反应与基因表达调控，形成保护性反应。
[0005] 目前，国际上很多研宄小组从正向遗传学和反向遗传学多个方向在植物抗逆机理 的研宄中取得了较大的研宄进展，其中包括抗干旱的脱落酸（abscisic acid，ΑΒΑ)途径、冷 害的 CBF (C-repeat binding factor)途径、和抗盐的 SOS (Salt Overly Sensitive)途径 等。这些信号途径的建立为我们研宄单个基因介导胁迫反应的机理，也为建立多种植物激 素和信号分子之间的交叉应答（如细胞分裂素、乙烯和茉莉酸调控冷胁迫应答，ABA、一氧 化氮和多胺调控植物非生物胁迫应答等）提供了有效的理论依据。已经在拟南芥、矮牵牛、 水稻、大豆、小盐芥和棉花等高等植物中陆续分离了一些抗性基因，这类基因广泛参与调控 植物的生长发育和胁迫应答反应。因此，探宄植物对各种胁迫的抗性机制，发现新的抗性基 因具有?米远意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供了一种增强植物对干旱抗性的拟南芥AtPED2基因及其表 达载体和转化细胞，该基因的组成型表达可以增强植物对干旱的抗性，可应用于抗性育种。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供了一种拟南芥AtPED2基因的制备方法，该方法简 单易行，操作简便，根据SEQ ID No. 1所示核苷酸序列，获得AtPED2基因全长序列的电子克 隆后，应用常规的PCR方法即可获得该基因。
[0008] 本发明的再一个目的在于提供了一种拟南芥AtPED2基因在增强植物对干旱抗性 中的应用。拟南芥AtPED2基因的超表达显著增强了植物对干旱的抗性。
[0009] 为了实现本发明的上述目的，发明人通过大量试验研宄并探索，最终获得了如下 技术方案：
[0010] 一种从拟南芥中分离的AtPED2基因，其序列为SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列， 或者是SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获 得的保守性变异体。
[0011] 需要说明的是，本发明同时还提供了所述AtPED2基因的表达载体；进一步优选该 表达载体是PBARN质粒载体。另外，本发明还提供了含有上述表达载体的细胞；进一步优选 该细胞是大肠杆菌DH5 α或根癌农杆菌GV3101。
[0012] 另一方面，本发明提供一种拟南芥AtfED2基因的制备方法，其步骤是：
[0013] (1)在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒（购自 Invitrogen公司，以下相同）的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无 RNase的双 蒸水中。DNase I (购自Promega公司，以下相同）去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪 (DM650BECKMAN，MSA)分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1 % (质量体 积比）琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的 cDNA分装后于-20°C保存备用。
[0014] (2)根据拟南芥公共数据库TAIR(http://www. arabidopsis. org/)中拟南芥 AtPED2基因序列（At5g043400),在该基因⑶S(Coding sequence，编码序列，以下相 同）起始密码子和终止密码子同源区域设计引物（序列为F-5' -TCATTTCATTTGGAGAGCCC ATGGCAACTCATCAGCAAAC-3'， R-5' -AGGATCCGATTCGTACACCCTTAGTTCCCTTCCTGGCTGA-3' ）， 从而确保扩增产物为全长序列。以拟南芥的叶片的cDNA为模版，进行PCR扩增。回收并 纯化扩增的PCR产物，连接到pEASY-T载体（购自武汉群骏生物科技有限公司）上，用冻 融法转化大肠杆菌DH5a，涂布于含有氨苄青霉素50 μ g/mL的LB固体（配方如下：分别 称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容 于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高压消毒15分钟。4°C 冷藏备用）平板上，37°C培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测：所用引物序列为： M13F 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3;M13R 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3,以下相同）， 反应体系为：l〇XTaq 酶反应缓冲液 2yl、25mM MgCL21.2yl、2mM dNTP 1·5μ1、10μΜ 引 物0. 2 μ 1、0. 3单位Taq酶，加无菌水至20 μ 1。反应程序为：94°C变性5min，94°C 45s、 55°C 45s、72°C 2min32循环，72°C延伸5min(以下相同）。以M13F/M13R为引物（前面已 述），将连接过的PEASY-T载体进行序列测定，分析结果，获得了一种分离的基因，其序列为 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0015] 与现有技术相比，本发明涉及的AtPED2基因具有以下如下优点和有益效果：
[0016] (1)通过克隆该基因，研宄该基因在植物抗干旱胁迫中的作用，明确了该基因具有 增强植株对干旱胁迫抗性的功能。通过该基因的过表达，研宄人员可以人工创造抗性增强 材料，为实现抗性分子育种提供新的抗性基因。
[0017] (2)通过构建该基因的超表达载体（35SpBARN-AtPED2)，转化拟南芥，获得有效的 的超表达（35SpBARN-AtPED2)转基因植株，为研宄基因功能提供了一个有效的方法。
[0018] (3)通过比较35SpBARN-AtPED2超表达株与野生型拟南芥的抗旱性，发现 35SpBARN-AtPED2超表达株在干旱胁迫处理条件下的存活率是野生型拟南芥的两倍以上。
[0019] 综上所述，本发明涉及的AtPED2基因可以增强植物对干旱胁迫的抗性，尤其是首 次通过基因工程技术提高AtPED2基因的表达，发现其能够增强植物对干旱胁迫的抗性，因 此可作为基因工程的候选基因用于分子育种。
【附图说明】
[0020] 图1为AtPED2基因超表达载体35SpBARN-AtPED2的构建示意图。
[0021] 图2为AtPED2基因超表达转化株中，AtPED2基因的表达水平图。图A表示这些植 株中AtPED2基因的相对表达水平。结果显示三个AtPED2基因超表达转化植株中AtPED2基 因的相对表达水平显著高于野生型植株。图B表示21天大小的野生型植株和三个AtPED2 基因超表达转化植株的生长28天的图。
[0022] 图3为AtPED2基因超表达转化株和野生型植株的干旱胁迫抗性鉴定图。图A表 示14天的野生型植株和两个AtPED2基因超表达转化植株在正常情况浇水21天（即每三 天浇水一次，保持土壤湿润），和不浇水21天后的植株生长情况。图B表示14天的野生型 植株和两个AtPED2基因超表达转化植株在正常情况浇水21天和不浇水21天后的植株的 存活率统计。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征。并且，在不偏离本发明精神和范围的前提 下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
[0024] 实施例1 :拟南芥AtPED2基因的制备
[0025] 在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒（购自 Invitrogen公司，以下相同）的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无 RNase的双蒸 水中。DNase I (购自Promega公司，以下相同）去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DM 650BECKMAN，MSA)分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1 % (质量体积比） 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA分 装后于-20°C保存备用。
[0026] 根据拟南芥公共数据库 TAIR(http://www. arabidopsis. org/)中拟南芥 AtPED2 基因序列（At5g043400)，在该基因基因 CDS(Coding sequence，编码序列，以下相同）起 始密码子和终止密码子同源区域设计引物（序列为F-5' -TCATTTCATTTGGAGAGCCCATGGCA ACTCATCAGCAAAC-3'，R-5' -AGGATCCGATTCGTACACCCTTAGTTCCCTTCCTGGCTGA-3'），从而确 保扩增产物为全长序列。以拟南芥的叶片的cDNA为模版，进行PCR扩增。回收