小麦雄性不育基因wms及其花药特异性启动子的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小麦雄性不育基因 WMS及其花药特异性启动子的应用。 二、 技术背景
[0002] 植物雄性不育对于选择育种和杂交制种至关重要。在很多植物上，发现了大量的 雄性不育株系，对于它们的收集和保存为现代农业提供了宝贵的遗传和种质资源。近年来， 人工创制的植物雄性不育系，尤其对于重要粮食作物水稻（Oryza sativa L )和玉米（Zea mays L.)，在生产上开始发挥作用。
[0003] 美国先锋公司（Pioneer Hi-Bred International)创制了新型种子生产技术 (Seed Production Technology, SPT)(Waltz. 2012. Nature Biotechnology 30:215-217)〇 在玉米上，SPT技术应用到3个关键基因：显性雄性可育基因 Ms45,隐性雄性不育基因 ms45 和红色荧光（可视）标记基因 DsRed2。先锋公司构建了携带Ms45和DsRed2各自表达框 架的植物表达载体（简称Ms45-DSRed2)，其中可育基因 Ms45受花药特异性启动子驱动，可 视标记基因 DsRed2受组成型启动子驱动。先锋公司将Ms45-DsRed2载体导入玉米雄性不 育系（ms45/ms45)，创制了玉米雄性不育保持系 DP-32138-1 (ms45/ms45, Ms45-DsRed2/_)。 DP-32138-1作为花粉供体，为玉米雄性不育植株（mS45/ms45)授粉，不育株上收获的种子 再经可视荧光自动分拣技术，获得玉米雄性不育系（m S45/ms45)和玉米雄性不育保持系 DP-32138-l(ms45/ms45, Ms45-DsRed2/_)，其中的不育系可用于杂交种生产。在创制植物 雄性不育系方面，利用花药特异性启动子驱动不育基因至关重要，有助于降低其它非预见 性风险。在水稻上，罗等人（2006)通过cDNA差显技术鉴定到花药绒毡层特异性表达的 基因 RTS，该基因主要在减数分裂时期的绒毡层表达，其表达在植株开花前消失（Luo et al. 2006. Plant Molecular Biology 62:397-408)。刘等人（2013)借助高通量技术发现 了水稻花药特异性表达的基因 LTP6,该基因编码脂类转运蛋白（Liu et al. 2013. Planta 238:845-857)。总之，采用花药特异性启动子驱动植物雄蕊育性相关基因，对于雄性可育/ 不育系的创建和杂交种的生产有重要意义。
[0004] 太谷核不育小麦（Triticum aestivum L.)是我国上世纪70年代初发现的"无 花粉型"自然突变体，该表型受单显性核基因 Ms2(原始命名Tal)控制，位于小麦4D染色 体的短臂（邓景扬，高忠丽.1980.作物学报6:85-98)。由于太谷核不育表现为单基因显 性遗传，决定雄性不育的基因只能处于杂合状态（Ms2/ms2)，当接受雄性可育小麦（ms2/ ms2)花粉所产生的种子中，大约50%的种子发育成雄性可育植株（ms2/ms2)，其余的种 子形成雄性不育植株（Ms2/ms2)。上世纪80年代，刘秉华等人创制了携带显性矮杆基因 Rht-Dlc (原始命名RhtlO)的太谷核不育小麦（简称'矮败小麦'）（Shu/ed. 2009. Induced Plant Mutations in the Genomics Era/FA0/Rome:370_372)。'矮败小麦'中 Rht-Dlc 基 因和Ms2基因紧密连锁（Cao et al. 2009. Genome 52:95 - 99 ;Shu/ed. 2009. Induced Plant Mutations in the Genomics Era/FA0/Rome:370_372)，本发明称之为 Rht_Dlc_Ms2 位点 (简称RMs2位点）。自1983年，Ms2基因和RMs2位点成为小麦轮回选择的重要工具。到 目前为止，中国已经回交转育了数百份携带Ms2或RMs2位点的小麦品系（本发明统称'太 谷核不育小麦'），并利用它们选育了 40多份小麦品种。 三、
【发明内容】
[0005] 为了解决人为控制植物育性的问题，本发明提供了一种小麦雄性不育基因丽S及 其花药特异性启动子的应用。具体涉及小麦雄性不育基因 WMS、该基因的花药特异性启动子 及它们的应用。
[0006] 本发明利用RNA测序（RNA-Seq)对比了小麦近等基因系'鲁麦15'和'鲁麦 15+Ms2'（简称'鲁麦15 Ms2'）减数分裂初期的花药转录组（transcriptome)，从中鉴定只在 '鲁麦15Ms2'花药组织中表达的基因；本发明从'鲁麦15 Ms2'中获得了控制小麦雄性不育的 基因，命名为丽S基因。结果表明，丽S基因影响小麦雄蕊发育，人工调控丽S基因可以改 变植物雄蕊的育性。另外，WMS基因启动子具有花药特异性驱动的活性，可以实现目标基因 的花药特异性表达。因此，本发明可用于实现目标基因的花药特异性表达、创建植物雄性不 育特性、建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术。
[0007] 丽S基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO: 1所示；丽S基因编码的蛋白（即丽S蛋 白）氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；WMS基因组全长表达框架，包括启动子、基因组编码 区和终止子，其核甘酸序列如SEQ ID NO:4 ;WMS基因启动子核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所 示；丽S基因组转录区段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0008] 本发明主要涉及编码小麦WMS蛋白及其同源蛋白的CDNA、合成DNA和基因组DNA 的应用。本领域的技术人员利用常规技术即可获得丽S基因相关的cDNA和基因组DNA。 对于cDNA的制备大致需要如下步骤：a)从'太谷核不育小麦'或其它物种中提取信使 RNA(message RNA，mRNA) ;b)利用mRNA作为模板合成cDNA ;c)根据本发明WMS基因全长 cDNA序列SEQ ID NO: 1设计PCR引物，然后从cDNA模板中扩增WMS基因或其同源基因；d) 将PCR产物克隆到质粒载体，获得WMS基因或其同源基因的cDNA。同理，本领域的技术人员 也可以从'太谷核不育小麦'或其它物种中提取基因组DNA，用以创建基因组DNA文库（如 BAC、cosmid、fosmid等类型文库），再利用基于本发明WMS基因组全长表达框架的核苷酸 序列（SEQ ID NO: 4)的DNA探针或PCR引物筛选DNA文库，获得携带WMS基因的阳性质粒。 也可采用长片段PCR方法，利用本发明WMS基因组全长表达框架的核苷酸序列（如SEQ ID NO: 4)的特异PCR引物，从植物基因组DNA或质粒DNA直接扩增丽S基因或其同源基因，进 而将PCR产物连接到克隆载体。
[0009] 本发明包括任何DNA片段，只要它们编码的蛋白与丽S蛋白（SEQ ID NO: 2)功能 等价。本文所指的"与丽S蛋白功能等价"意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功 能和生理生化特征等方面与本发明中丽S蛋白（SEQ ID N0:2)类同。丽S蛋白典型的生 物学功能是诱导植物雄性不育。为验证丽S基因是否诱导小麦雄性不育，可使用甲基磺 酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS)创建'太谷核不育小麦'的突变群体（实施例7)，再 用定向诱导基因组局部突变（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING) 技术筛选丽S基因敲除（knockout)或敲低（knockdown)的突变植株（实施例8)，然后 分析丽S基因突变对'太谷核不育小麦'雄蕊发育的影响。为明确丽S基因的功能，也 可采用遗传互补（genetic complementation)手段加以验证。本发明利用基因枪轰击 (biolistics bombardment)技术将WMS基因组全长表达框架载体（SEQ ID N0:7)导入雄 性可育小麦'Bobwhite'（实施例9);也利用农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated transformation)方法将WMS基因组全长表达框架（SEQ ID NO: 7)导入雄性可育的禾本科 植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.)(实施例10);对于所获得的转基因植株， 分析了丽S基因的表达对雄蕊发育的影响。
[0010] 丽S基因的一个突出特点为花药组织的特异性表达，即丽S基因在花药组织的表 达较其它组织高出5倍或更多，优选高出10倍或更多，更优选高出15倍或更多（实施例 5)。为评价基因是否在花药组织特异性表达，从各种植物组织分别提取mRNA，再合成相应的 cDNA，然后米用定量 PCR (quantitative reverse-transcription PCR，qRT-PCR)测定目标 基因 cDNA在不同组织中的相对含量（实施例5)。
[0011] 如果DNA片段编码的蛋白功能等价于丽S蛋白（SEQ ID NO: 2)，这些DNA片段的优 选来源是单子叶植物（monocotyledon)，更优选来源是禾本科植物（Gramineae)，最优选来 源是小麦族植物（Triticeae)。这些DNA片段包括本发明核苷酸序列（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:6)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明 WMS蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除、或插 入现象，都属于本
【发明内容】
。
[0012] 基因组编辑（genome editing)技术，可以定向敲除目的基因，在动植物上均有应 用（Cheng and Alper. 2014. Current Opinion in Biotechnology 30:87-94)。部分基因 组编辑技术，如锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFNs)，转录激活类效应因子核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和规律性重复短回文序列 族（clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats，CRISPR)，在主要粮 食作物小麦（Shan et al. 2014. Nature Protocols 9:2395-2410 ;Wang et al. 2014. Nature Biotechnology 32:947-951)和大麦（Wendt et al. 2013. Plant Molecular Biology 83:279-285 ;Gurushidze et al. 2014. PLoS ONE 9:e92046)上得到了成功应用。基因组编 辑技术会造成目标基因特定区域发生一个、数个或数十个碱基的删除或插入、导致基因突 变，位于转录区域的DNA变异则可能会造成编码蛋白的变异或截短（truncation) (Wang et al. 2014. Nature Biotechnology 32:947-951)。转录区域DNA的喊基突变也会引起编码蛋 白的氨基酸改变。利用基因组编辑或碱基突变创建的DNA片段，其编码的蛋白与WMS蛋白 (SEQ ID N0:2)相比，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除、或插入等现象，但只 要该DNA片段编码的蛋白与WMS蛋白（SEQ ID N0:2)功能等价，该DNA片段即属于本发明 内容。本发明界定的DNA片段还包括那些发生了碱基突变，但不改变编码蛋白序列的突变， 即保守突变（conservative mutation) 〇
[0013] 对于本领域的技术人员，可以采用基因组编辑技术改变本
【发明内容】
中丽S基因 (如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:6)及其同源基因序列。另外，目标基因的变异可以通过突 变诱导产生或通过种质筛选鉴定本已存在的自然变异。比如，Slade等人（2005)创建了 小麦的EMS突变群体，进而采用TILLING技术鉴定目标基因的点突变（Slade et al. 2005. Nature Biotechnology 23:75-81)。自然种质的长期进化积累了大量的变异，也可以采用 Ecotilling手段从自然种质或育成品种中鉴定目标基因的变异（Till et al. 2006. Nature Protocols 1:2465-2477)。对于本领域的技术人员，可以创建相关植物材料的突变群体，再 从中筛选本
【发明内容】
中DNA片段（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)发生变异的个体。本领域 的技术人员还可以从相关植物的自然种质或育成品种中鉴定本发明DNA片段（SEQ ID N0:1 或SEQ ID N0:6)的自然变异。因此，本发明还涵盖：a)所有通过基因组编辑、诱变或自然 变异筛选而获得的携带本
【发明内容】
的DNA片段（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)发生变异的 植物细胞；b)携带a)项植物细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆或植株后代等，只要 它们仍携带a)项植物细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器官等， 只要它们仍携带a)项植物细胞。
[0014] 对于本领域的技术人员，获得DNA片段、使得它们编码的蛋白与丽S蛋白（SEQ ID N0:2)功能等价的方法很多，如 PCR 方法（Saiki et al.l985.Science 230:1350-1354; Hemsley et al. 1989.Nucleic Acids Research 17:6545-6551 ；Landt et al. 1990. Gene 96:125-128)、DNA 重组技术和 DNA 人工合成技术（Kosuri and Church. 2014. Nature Methodsl1:499-507)。可以说，对于本领域的技术人员，从小麦或其它植物中获得与丽S 基因高度同源的DNA片段为常规技术，可利用对应本发明核苷酸序列（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)的PCR引物，或使用对应本发明核酸序列（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)的DNA 探针，通过筛选基因组DNA或cDNA文库，获得相应的DNA片段。对于DNA片段的获得，无 论是通过PCR方法、DNA重组、DNA人工合成还是其它同类技术，只要这些DNA片段所编码 的