一种提高大豆籽粒重量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及提高大豆籽粒重量的方法。
【背景技术】
[0002] 作物对不良生长环境的抗性及对养分的有效利用是影响其产量的主要限制因素。 蔗糖是高等植物主要的糖类，具有很多重要的功能，它是碳水化合物的主要转运形式、是一 种储存化合物、还作为渗透保护物存在。蔗糖可以被蔗糖合成酶和蔗糖转化酶代谢。蔗糖 转化酶（INV)通过将蔗糖水解成葡萄糖和果糖来调节蔗糖进入不同的途径。由于糖分不仅 是营养物质还参与重要基因的表达调控，因此INV参与细胞分裂，植物生长发育过程，并与 植物抵抗病原物和不良环境作用密切相关。以玉米种子中淀粉积累会受到不利影响为例来 说明，这种影响是由于在花梗和胚乳间同化物质运输受到细胞壁INV表达量减少的干扰而 造成的；另有研宄证实香?的种皮相关INV具有控制卸载和储存的两种功能；水稻的种子 灌浆也是被一种细胞壁INV调控的，通过对转INV基因的水稻进行检测证实INV确实能够 提高籽粒灌浆进而提高水稻的产量。
[0003] 植物蔗糖转化酶定位在液泡、细胞质和细胞壁几个部位上。这些不同的蔗糖转化 酶同工酶都有着各自特殊的功能而受到单独的调控。已经有一些蔗糖转化酶的同工酶被克 隆出来，它们的表达研宄遵守不同的发育调控。
[0004] 目前蔗糖转化酶抑制酶（INHs)基因已经陆续从烟草，玉米，拟南芥和番茄等植物 中分离出来，对其功能也做了多方面的研宄。大量的研宄表明，通过反义RNA或RNAi技术 可以沉默植物体内的INH来提高INV的活性，进而实现使作物增产及提高作物抵御不良生 物和非生物胁迫影响的作用。
[0005] 到目前为止一直没有从大豆品种黑农46中克隆INH基因的报道，因此迫切需要研 宄通过从大豆中克隆出INH基因，便于通过转基因技术培育高产抗逆的转基因作物，为大 豆高产基因工程提供了具有自主知识产权的基因资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是从大豆品种黑农46中克隆出的两种蔗糖转化酶抑制酶基因，然 后用其解决目前大豆籽粒重量低致使产量不高的问题，而提供一种提高大豆籽粒重量的方 法。
[0007] -种提高大豆籽粒重量的方法，它按以下步骤实现：
[0008] -、大豆蔗糖转化酶抑制酶基因的cDNA克隆：
[0009] 通过NCBI网上数据库资源比对筛选大豆cDNA文库及EST文库，筛选出与已报导 的INH(蔗糖转化酶抑制酶）基因在特有氨基酸序列保守序列上相近的潜在INH基因，并分 别命名为GmINHl和GmINH2 ;
[0010] 其中，步骤一中所述GmINHl的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示，其编码蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO :2所不；
[0011] 步骤一中所述GmINH2的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示，其编码蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO :4所示；
[0012] 二、RNAi沉默载体的构建：
[0013] 选取GmINH2编码区362bp的正向序列及相对应的反向序列，中间插入大豆FAD2 基因的内含子，构成发夹结构的颈环区，然后用BamH I和Sac I双酶切连于pCAMBIA3300 中，构建载体命名为pCAMBIA3300-GmINH2I ;
[0014] 以大豆FAD2基因的内含子为RNAi内含子颈环结构，分别扩增出约250bp的 GmINHl和GmINH2基因片段，顺次连接组成RNAi结构的正向结构，同时扩增出其反向结构， 分别正反向连于FAD2I的两侧，构建在载体pUC18中，构建成RNAi的典型结构，然后用BamH I和Spe I双酶切连于pCAMBIA3300中，构建载体命名为pCAMBIA3300-GmINHl&2I ;
[0015] 三、两个基因的沉默载体对大豆的转化：
[0016] 使用的启动子为35S，终止子为Nos，筛选标记基因为bar基因，大?的再生体系以 子叶节为外植体诱导再生植株的再生系统，采用农杆菌介导技术将pCAMBIA3300-GmINH2I 和pCAMBIA3300-GmINHl&2I导入到大豆品种哈交5337中进行组成型表达，获得PCR阳性株 系，即完成提高大豆籽粒重量。
[0017] 本发明从大豆品种黑农46中克隆出的两种INH基因，通过转化后具有对大豆蔗糖 转化酶明显的抑制功能，并使转化植株种子的百粒重明显增加。酶活分析GmINHl和GmINH2 基因抑制酶效果显著，说明这两个基因具备蔗糖转化酶抑制酶功能，组织特异性表达分析 GmINHl和GmINH2基因在花中的表达量最高。构建的GmINHl和GmINH2基因 RNAi载体对大 豆哈交5337进行遗传转化，转基因后代种子的百粒重相比对照显著提高。
【附图说明】
[0018] 图1为实施例中GmINHl和GmINH2与其他物种的蔗糖转化酶抑制酶比对显示出4 个半胱氨酸残基的保守性的图；
[0019] 图2为实施例中大豆GmINHl在不同组织表达的相对定量结果图，其中YL表示幼 嫩叶片；ML表不成熟叶片；FL表不花；YS表不幼嫩种子；MS表不成熟种子；YP表不幼嫩豆 荚；
[0020] 图3为实施例中大豆GmINH2在不同组织表达的相对定量结果图，其中YL :幼嫩叶 片；ML :成熟叶片；FL :花；YS :幼嫩种子；MS :成熟种子；YP :幼嫩豆荚；
[0021] 图4为实施例中转GmCIF2I后代大豆PCR检测结果的电泳图，M :DL2000 ;泳道1 : 阳性质粒；泳道2 :水对照；泳道3 :哈交5337 ;泳道4 :INH2I-1，泳道5 :INH2I-2 ;
[0022] 图5为实施例中转GmCIFl&2I后代大豆PCR检测结果的电泳图，M :DL2000 ;泳道 1 :阳性质粒；泳道2 :水对照；泳道3 :哈交5337 ;泳道4 :INH2I-1，泳道5 :ΙΝΗ1&2Ι-2 ;
[0023] 图6为实施例中转GmINHl基因的大豆种子与受体大豆比较结果图；
[0024] 图7为实施例中转GmINH2基因的大豆种子与受体大豆比较结果图。
【具体实施方式】
[0025] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0026] 一：本实施方式提高大豆籽粒重量的方法，它按以下步骤实现：
[0027] -、大豆蔗糖转化酶抑制酶基因的cDNA克隆：
[0028] 通过NCBI网上数据库资源比对筛选大豆cDNA文库及EST文库，筛选出与已报导 的INH基因在特有氨基酸序列保守序列上相近的潜在INH基因，并分别命名为GmINHl和 GmINH2 ；
[0029] 其中，步骤一中所述GmINHl的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示，其编码蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO :2所不；
[0030] 步骤一中所述GmINH2的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示，其编码蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO :4所示；
[0031] 二、RNAi沉默载体的构建：
[0032] 选取GmINH2编码区362bp的正向序列及相对应的反向序列，中间插入大豆FAD2 基因的内含子，构成发夹结构的颈环区，然后用BamH I和Sac I双酶切连于pCAMBIA3300 中，构建载体命名为pCAMBIA3300-GmINH2I ;
[0033] 以大豆FAD2基因的内含子为RNAi内含子颈环结构，分别扩增出约250bp的 GmINHl和GmINH2基因片段，顺次连接组成RNAi结构的正向结构，同时扩增出其反向结构， 分别正反向连于FAD2I的两侧，构建在载体pUC18中，构建成RNAi的典型结构，然后用BamH I和Spe I双酶切连于pCAMBIA3300中，构建载体命名为pCAMBIA3300-GmINHl&2I ;
[0034] 三、两个基因的沉默载体对大豆的转化：
[0035] 使用的启动子为35S，终止子为Nos，筛选标记基因为bar基因，大?的再生体系以 子叶节为外植体诱导再生植株的再生系统，采用农杆菌介导技术将pCAMBIA3300-GmINH2I 和pCAMBIA3300-GmINHl&2I导入到大豆品种哈交5337中进行组成型表达，获得PCR阳性株 系，即完成提高大豆籽粒重量。
【具体实施方式】 [0036] 二：本实施方式与一不同的是，步骤一中所述已报导 的INH基因，其GenBank登录号分别为BT090960. 1和BT091584. 1。其它步骤及参数与具体 实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0037] 三：本实施方式与一不同的是，步骤一中所述GmINHl 基因的全长711bp，具有549bp完整的开放读码框核苷酸序列，编码182个氨基酸，其成熟酶 蛋白的分子量为19. 7kD。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0038] 四：本实施方式与一不同的是，步骤一中所述GmINH2 基因的全长729bp，具有555bp完整的开放读码框核苷酸序列，编码184个氨基酸，其成熟酶 蛋白的分子量为19. 8kD。其它步骤及参数与一相同。
[0039] 采用以下实施例验证本发明的有益效果：
[0040] 实施例：
[0041] 提高大豆籽粒重量的方法，它按以下步骤实现：
[0042] 1、大豆蔗糖转化酶抑制酶基因的cDNA克隆：
[0043] 通过NCBI网上数据库资源比对筛选大豆cDNA文库及EST文库，筛选出与已报导 的INH基因在特有氨基酸序列保守序列上相近的潜在INH基因，并分别命名为GmINHl和 GmINH2 ；
[0044] 其中，步骤一中所述GmINHl的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示，其编码蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO :2所不；
[0045] 步骤一中所述GmINH2的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示，其编码蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO :4所示；
[0046] 本实施例中GmINHl和GmINH2,通过BLAST比对揭示这两个基因与其他物种的INH 基因都具有保守的4个半胱氨酸残基（图1)，这是所有已知的INH都具有的一个标志。
[0047] GmINHl基因的全长711bp，具有549bp完整的开放读码框核苷酸序列，编码182 个氨基酸；GmINH2基因的全长729bp，具有555bp完整的开放读码框核苷酸序列，编码184 个氨基酸。针对氨基酸序列，应用ExPASy在线工具软件预测基因的信号肽部分（http:// cn. expasy. org/tools/proteome)，将去除信号肽部分的全长编码区构建在原核表达 Gateway系统（Invitrogen公司）中。构成含有该系统特异识别的引物，采用两步P