一种用于检测沙门氏菌的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测沙门氏菌的试剂盒及其检测方 法。
【背景技术】
[0002] 人畜共患病是指由同一种病原体引起，流行病学上相互关联，在人类和动物之间 自然传播的疫病。其病原包括病毒、细菌、支原体、螺旋体、立克次氏体、衣原体、真菌、寄生 虫等。这类疾病的特性在于很不容易消灭。因此这些病原微生物的存在会对人类健康、畜 牧业安全生产、畜产品安全和公共卫生造成重大危害，从而造成巨大的经济损失。在实验室 研宄方面，携带或者潜在携带病原微生物的动物会对后续科学实验产生较大的影响，因此 对于病原微生物的检测就变得尤为重要。
[0003] 目前检测人畜共患病原微生物的方法还是主要集中在传统的生化方法和基于抗 原抗体的免疫学方法，这些方法的检验程序十分复杂繁琐，且耗时较长，并且部分检验过程 及结果判定需要操作人员的主观判断，因此新的试剂盒和检测方法的引入就势在必行。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于检测沙门氏菌的 试剂盒及其检测方法。
[0005] 所述的一种用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于包括引物FP和引物RP，所述 引物FP的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述的引物RP的核苷酸序列如SEQ ID NO :2 所示。
[0006] 所述的一种用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于所述的引物FP含量为 2. 5ul，所述引物RP含量2. 5ul。
[0007] 所述的利用试剂盒进行沙门氏菌检测的方法，其特征在于包括以下步骤：以检测 样品的DNA为模板，以引物组FP和引物RP进行PCR扩增，当扩增产物在456bp处出现一 条特异性核酸带时，判断为样品中含有沙门氏菌DNA。
[0008] 所述的方法，其特征在于PCR体系中含有检测样品的DNA 150 ng、引物FP2.5ul、 引物 RP2. 5ul、Taq 酶 12. 5ul、ddH20 补足 25 ul。
[0009] 所述的方法，其特征在于PCR反应条件：98°C预变性30s，98°C变性10 s，52 °C退 火30 s，72 °C延伸45s，循环35次，最后72 °C总延伸10 min。
[0010] 本发明的有益效果：本发明通过特异引物的设计，采用高通量测序的方法，可实现 多至5000份样本中各种病原菌或病毒的一次性快速检测，实现24-48小时内致病源的确 诊；不仅可发现各种病原菌或病毒的变异程度，更能判别其传染性，为后续的公共卫生防疫 及政府决策提供依据。
【附图说明】
[0011] 图I gyrB基因通用引物引物测试电泳结果图； 图2优化引物结构组成图； 图3沙门氏菌模板浓度梯度实验电泳结果图。
【具体实施方式】
[0012] 为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实 验方法，通常按常规实验方法进行。 实施例
[0013] 1研宄对象 小鼠，包括经病原微生物感染小鼠及正常健康小鼠。
[0014] 2研宄范围 2. 1沙门氏菌 表1本研宄用沙门氏菌菌种基本信息
参考项目研宄背景沙门氏菌部分，可以发现鼠伤寒沙门氏菌TA98冻干株、鼠伤寒沙门 氏菌TA100冻干株、甲型副伤寒沙门氏菌CMCC (B) 50093冻干株和肠炎沙门氏菌分别为沙 门氏菌亚种S. enterica subsp. enterica (I)之下的B群、A群和D群血清型沙门氏菌。 鼠伤寒沙门氏菌TA98冻干株和鼠伤寒沙门氏菌TA100冻干株同属B群血清型沙门氏菌，它 们之间的区分很难达成，主要是因为这两个冻干株实际上都是鼠伤寒沙门氏菌，只是属于 不同的菌株，菌株的水平又比血清型分类水平更进一步。因菌株之间的同源性几乎是接近 了 100%，可能它们整个的基因组序列之间也只存在几个碱基的差别，因此它们之间的区分 是很难达成的。如若存在差异碱基的区域无法寻获，只能将两者作为同一菌种进行研宄。
[0015] 2. 3实验样本信息 本发明具体样品信息见表2。
[0016] 表2样品信息汇总
实验体系中设置志贺杆菌的原因：由于沙门氏菌和肠科杆菌(如大肠杆菌、志贺杆菌 等）同源性非常高，因此要准备部分志贺杆菌感染的小鼠粪便DNA，以便检测设计的引物是 否能将沙门氏菌与其他肠科杆菌进行区分，保证结果不存在假阳性。
[0017] 实验体系中设置复合沙门氏菌的原因：假设小鼠感染多种沙门氏菌时，检测设计 的引物是否能同时扩增多种沙门氏菌，并且是否能够将各菌种进行区分。
[0018] 实验体系中设置多种浓度梯度的肠炎沙门氏菌的原因：以肠炎沙门氏菌作为例 子，检测所设计的实验体系能检出的最低的菌种浓度。
[0019] 2.4实验试剂、仪器及耗材 Premix Ex TaqTM Hot Start VersionCTakara,RR030A),DL2000 DNA MarkerCTakara, 3427)， Axygen PCR Clean Up Kit (Axygen， AP-PCR-500)， QubitdsDNA HS Assay Kit (Invitrogen，Q32851)，PrimeSc;ript? RT reagent Kit (Takara, DRR037A)，L96G 梯度型 PCR 仪（LongGene，L96G)，Illumina Miseq 高通量测序仪。
[0020] 3菌种分类优选区域选择 菌种分类优选区域的选择是一个步步推进的过程，主要是通过以下几步骤完成： (1)文献查找 通过文献查找，针对沙门氏菌，要寻找在研宄范围内的几个菌种相互之间差异变化大 的区域，所以首先筛选得到5大类区域。
[0021] (2)序列比对 因需研宄的物种的序列信息未知，因此要到NCBI等数据库中去找沙门氏菌这几个菌 种的典型菌株，例如，鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella entericaserovarTyphimurium)就可以 找它的典型菌株LT2、ST4/74等作为研宄对象。
[0022] 此步骤主要是通过序列比对，去除经比对菌种间同源关系极高的区域。通过这一 步的选择，主要是在细菌特有的基因中起到了一个非常重要的筛选作用，筛选后发现只有 gyrB基因符合条件。
[0023] (3 )通用引物设计及引物测试 针对每个优选区域设计通用引物，所谓通用引物，既是该引物在多个菌种中都能PCR 扩增得到产物。然后对这些引物进行引物测试，在该过程中会淘汰大批的引物。经过测试， 16S rDNA (备选)、23S rDNA、gyrB各有一对引物通过测试。
[0024] 针对核糖体基因间隔区（包括23S~5S rDNA和16S~2