一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测领域，涉及一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的 试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 艾滋病即获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一种慢性致死性传染病，由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV)引起，分为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-I)和人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2)，HIV-I 是目前全球包括中国在内流行的主要毒株，HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后导致 人体免疫机能缺陷，从而发生机会性感染和肿瘤等一系列临床综合征，病死率几乎达100%。 艾滋病至今尚无确切有效的治疗药物，HIV感染的早期发现、早期诊断是防止艾滋病流行 的重要手段，也是艾滋病预防控制工作的重要组成部分。
[0003] 实验室检测是诊断HIV感染的主要依据，根据检测水平的不同，可分为蛋白水平、 细胞水平和基因水平的检测。主要包括抗体和抗原检测、病毒分离和病毒核酸检测等。提 高HIV检测的敏感性，缩短窗口期是HIV早期诊断的主要研宄目的。
[0004] 蛋白水平检测主要包括HIV抗原检测及其机体针对抗原产生的特异性抗体，是 HIV感染诊断中最常用方法，可分为初筛实验和确认实验，分别以ELISA和Western blot方 法为代表，主要有"窗口期"长（14天至2个月）及容易受干扰物影响出现假阳性等缺点。
[0005] 细胞水平检测主要以细胞分离培养和CD4+淋巴细胞计数为主，前者能够直接检 测病毒，专一性很强，有高度的特异性，不会出现假阳性，且可以获得样品中原始病毒株，可 进一步进行耐药性和生物学特性研宄。但是其敏感性较低，周期长，费用高，需要在P3实验 室进行，易造成实验室感染，故临床应用较少。后者作为直接测定免疫功能的方法，可以用 于检测HIV感染进展状况、判断预后，了解机体免疫状态进行疾病分期，监测抗病毒治疗效 果等，但由于昂贵仪器及大量标本要求，无法对HIV早期感染进行检测，从而极少在HIV筛 查中应用。
[0006] 病毒核酸检测，目前以病毒载量（RNA)检测为主，利用分子生物学技术检测HIV 病毒核酸，不仅可以定性地检测样本中是否含有HIV病原体，辅助早期诊断HIV感染，缩 短窗口期；还可以对样本中病毒进行定量，即检测病毒载量，用于病程监控、指导治疗方案 及疗效判定和预测疾病进展等。目前国内外已上市的病毒载量检测试剂盒检出限在20~200 拷贝/mL之间，低于500拷贝/mL定量不稳定，另外标本收集及保存要求较高，RNA容易降 解，而且不同实验室和不同方法间病毒载量测定值变异很大，病毒载量绝对值不能直接比 较。HIV在感染细胞时通过逆转录作用形成大量前病毒DNA，部分整合到细胞基因组中，稳 定不易降解。因此近年来，研宄人员开发HIV前病毒DNA检测方法来替代病毒载量检测，据 文章报道的HIV-I DNA最低检出限在10拷贝/百万细胞以上。
[0007] 此外，目前HIV检测方法所用的标本主要来自HIV感染者或病人的血浆或全血。但 是这种些样本在采集、分离、保存和运输过程中不可避免地会遇到一些难题，如一些实验室 条件欠完善地区并不能及时地将采集的全血分离、冻存。此外，受生物危险品运输限制，全 血或血浆需专人冷链运输。为了解决上述问题，医护人员采用美国食品和药品管理局（FDA) 批准的国际通用903#滤纸，制备成干血斑样本，为筛查工作带来很多便利，如：可常温保存 运输，常温下可保存3个月以上，无病毒感染等。由于干血斑标本采样量少（50~75 μ L全 血)，使其检测灵敏度比血浆或全血标本检测灵敏度低10倍左右，一定程度上影响干血斑在 HIV筛查应用。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述问题，本发明通过开发一种简单高效的干血斑提取试剂，以及宄筛 选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，并设置特定的PCR反应程序和条件，构建 了高敏感干血斑标本中HIV-I DNA PCR检测试剂盒及检测方法。
[0009] 本发明的目的在于提供一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的方 法。
[0011] 本发明所采取的技术方案是： 一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，包含有核酸提取液和PCR反 应液，所述的PCR反应液中含有PCR引物组和检测探针； 所述引物组选自引物组1、引物组2和引物组3中的至少一组，其中： 引物组 1 由 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID Ν0:5 和 SEQ ID NO :6 组成； 引物组 2 由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 组成； 引物组 3 由 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成； 所述探针情况如下： 当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒至少含有探针SEQ ID NO: 15或其核苷酸互补序 列； 当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中含有探针SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针； 当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒含有探针SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
[0012] 进一步的，上述核酸提取液含有：10~50mM Tris-HCl (pH8. 0)、30~50mM KC1、 5~10%0^16叉100、0.5~1%1'1^〇11父-100、0.5~1%咿-40和10~5〇1111辛酸纳。
[0013] 进一步的，上述探针序列5'端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种， 探针序列3'端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
[0014] 进一步的，上试剂盒还包含细胞定量引物组和细胞定量探针； 所述细胞定量引物组由 SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和 SEQ ID NO: 26 组成； 所述探针为含SEQ ID NO:27或者为其核苷酸互补序列； 细胞定量探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于权利 要求3所述探针的荧光基团。
[0015] 进一步的，上试剂盒还含有：阴性对照、阳性定量参考品和含有酶与UNG酶的 酶系。
[0016] 进一步的，上述的阳性定量参考品为8E5或Ach2细胞株基因组，用于同时对HIV-I DNA及细胞数定量。
[0017] 一种干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的检测方法，包括以下步骤： 1) 干血斑核酸提取： 用打孔器将干血斑打孔，将打孔的样品置于离心管中；加入灭菌水，剧烈震荡3~5秒， 室温放置30分钟后震荡3~5秒；12000rpm离心I. 5~2. 5分钟，去上清液，留足够上清液盖没 沉淀；加入核酸提取液100 μ L，震荡3~5秒，放置于56°C震荡孵育25~30分钟；于95~100°C 孵育5~10分钟；12000rpm离心3~5分钟，转移上清到新离心管中作为DNA模板； 2) PCR反应体系： PCR 反应液 29. 2 μ L ; 酶系 0.8yL; DNA 模板 20 μ L ; 3) PCR反应程序： 以ΑΒΙ7500为例，第一步：37°C 5分钟；第二步：95 °C 10分钟；第三步：95 °C 15 秒，62~68 °C 15 秒，72°C 20 秒，5~8 个循环；第四步：95 °C 15 秒，62~65 °C 15 秒，72°C 20秒，5~8个循环；第五步：95°C 15秒，60°C 1分钟，40个循环；60 °C时采集 荧光； 4) 结果分析： 反应结束后自动保存结果，对HIV-I DNA的扩增曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别 分析；点击Analyze进行分析，使Std Curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation 数值介于-1. 〇〇. 98,然后到Plate窗口下记录定量结果； 细胞中HIV-I DNA含量结果计算： 同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIV-I DNA定量值除以细胞定量值，得出标本中 每个细胞中HIV-I DNA含量。
[0018] 进一步的，在上述整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求： ① 阴性对照：HIV DNA扩增曲线无 CT值显示； ② 阳性定量参考品的结果均为阳性，Ct值<30,且2条标准曲线线性相关系数0.98 ^ r ^ 1 ； 以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
[0019] 本发明的有益效果是： 1) 本发明的干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型PCR检测试剂盒灵敏度可达到血浆或 全血标本检测灵敏度，但更方便标本收集、存储、运输； 2) 本发明技术开发干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型PCR检测试剂盒及其检测方法 的检测方法可以同时对HIV-I D