重组细胞以及异戊二烯的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及能够由一氧化碳等特定的Cl化合物生产异戊二烯的重组细胞、以及 利用该重组细胞的异戊二烯的生产方法。
【背景技术】
[0002] 异戊二烯是合成聚异戊二烯的单体原料，尤其是在轮胎行业中为重要的原材料。 近年来，由依赖于石油的基础化学品的生产工艺向来自植物资源等可再生资源的生产工艺 的转换技术的开发与实用化正在稳步地进行。关于异戊二烯，例如已知以糖为原料的利用 重组大肠杆菌的生产技术（专利文献1、2)。
[0003] 关于来自可再生资源的生产工艺，包括上述异戊二烯生产技术在内，其现有技术 基本上是依赖于有机物、特别是糖、甘油或油成分等的利用微生物的生产法。但是，为了维 持来自石油的多种基础化学品的世界性生产量，在来自植物资源等的目前可使用的糖类、 甘油或油成分的量中，作为微生物的碳源不足是必须的。即，依赖于糖类或油成分的利用微 生物的基础化学品生产量今后也是有限的。而且，这种工艺还有可能与食物竞争。
[0004] 合成气（Synthesis gas, Syngas)是在高温·高压下通过金属催化剂的作用由废 弃物、天然气和煤炭有效得到的、以一氧化碳、二氧化碳和氢为主要成分的混合气体。在以 合成气为起点的利用金属催化剂的Cl化学的领域中，正在开发可廉价且大量生产甲醇、甲 酸、甲醛等液态化学品的工艺。
[0005] 另外，一氧化碳、二氧化碳和氢包含于废弃物来源的合成气或工厂废气、天然气、 或者煤炭来源的合成气中，几乎永久能够利用。但是，现状是极少有作为以合成气为代表的 Cl碳源的、利用微生物的化学品生产例。目前正在进行开发的仅仅是由合成气生产乙醇、 2,3_ 丁二醇等。尤其是，很少有关于基于重组体的合成气同化性物质的利用的报道。专利 文献3中公开了利用大肠杆菌重组体的异丙醇的生产技术。该技术中，将多个CO代谢酶基 因导入大肠杆菌以赋予合成气同化能力，由合成气生产异丙醇。但是，该技术并不生产异戊 二烯。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :日本特表2011-505841号公报
[0009] 专利文献2 :日本特表2011-518564号公报
[0010] 专利文献3 :日本特表2011-509691号公报
【发明内容】
[0011] 发明要解决的问题
[0012] 鉴于上述现状，本发明的目的在于提供能够由合成气等生产异戊二烯的一系列技 术。
[0013] 用于解决问题的方案
[0014] 用于解决上述课题的本发明的方式之一为一种重组细胞，其中，编码异戊二烯合 成酶的核酸被导入具有基于非甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力的宿主细胞中，该 核酸在所述宿主细胞内进行表达，所述重组细胞能够由Cl化合物生产异戊二烯，所述Cl化 合物为选自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇组成的组中的至少一种。
[0015] 本发明还涉及一种能够生产异戊二烯的重组细胞。本发明的重组细胞将编码异戊 二烯合成酶的核酸导入具有"基于非甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力"的宿主细 胞中而成，并且该核酸在宿主细胞内进行表达。而且，能够由选自由一氧化碳、二氧化碳、甲 酸和甲醇组成的组中的至少一种Cl化合物生产异戊二烯。根据本发明的重组细胞，可以由 所述Cl化合物合成异戊烯基二磷酸（IPP)，进而将所合成的IPP转换为异戊二烯。其结果， 可以由所述Cl化合物生产异戊二烯。通过利用本发明的重组细胞，例如可以由包含一氧化 碳或二氧化碳的合成气生产异戊二烯。
[0016] 类异戊二烯的生物合成途径大致分为甲羟戊酸途径（也称为MVA途径）和非甲羟 戊酸途径（也称为MEP途径）。非甲羟戊酸途径是由甘油醛-3-磷酸和丙酮酸最终生成异 戊烯基二磷酸（IPP)或二甲基烯丙基二磷酸（DMPP)的途径。本发明中使用的宿主细胞具 有基于非甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力。
[0017] 本发明的另一方式为一种重组细胞，其中，编码异戊二烯合成酶的核酸被导入具 有由甲基四氢叶酸、一氧化碳和CoA合成乙酰CoA的功能的宿主细胞，该核酸在所述宿主细 胞内进行表达，所述重组细胞能够由Cl化合物生产异戊二烯，该Cl化合物为选自由一氧化 碳、二氧化碳、甲酸和甲醇组成的组中的至少一种。
[0018] 本发明的重组细胞将编码异戊二烯合成酶的核酸导入具有"由甲基四氢叶酸、一 氧化碳和CoA合成乙酰CoA的功能"的宿主细胞而成，并且该核酸在宿主细胞内进行表达。 而且，能够由选自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇组成的组中的至少一种Cl化合物生 产异戊二烯。也可以利用本发明的重组细胞由所述Cl化合物合成IPP，进而将所合成的IPP 转换为异戊二烯。其结果，可以由所述Cl化合物生产异戊二烯。通过利用本发明的重组细 胞，例如可以由包含一氧化碳或二氧化碳的合成气生产异戊二烯。
[0019] 作为具有"由甲基四氢叶酸、一氧化碳和CoA合成乙酰CoA的功能"的细胞，可 例示出具有图1所示的乙酰CoA途径（Wood-Ljungdahl pathway)和甲醇途径（Methanol pathway)的厌氧性微生物。
[0020] 优选具有一氧化碳脱氢酶。
[0021] -氧化碳脱氢酶（EC 1. 2. 99. 2/1. 2. 7. 4)( -氧化碳脱氢酶、CO dehydrogenase、 CODH)具有由一氧化碳和水生成二氧化碳和质子的作用、以及作为其逆反应的由二氧化碳 和质子生成一氧化碳和水的作用。一氧化碳脱氢酶是利用乙酰CoA途径（图1)发生作用 的酶之一。
[0022] 优选所述宿主细胞为梭菌（Clostridium)属细菌或穆尔氏菌（Moorella)属细菌。
[0023] 优选进一步导入了编码通过甲羟戊酸途径发生作用的酶组的核酸，进一步具有基 于甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力。
[0024] 通过该构成，由甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径两者合成成为异戊二烯合成酶的 底物的IPP，可有效地进行IPP的供给。其结果，本发明的重组细胞的异戊二烯生产能力进 一步提尚。
[0025] 优选所述甲羟戊酸途径为酵母的甲羟戊酸途径。
[0026] 优选所述甲羟戊酸途径为原核生物的甲羟戊酸途径。
[0027] 优选所述甲羟戊酸途径为放线菌的甲羟戊酸途径。
[0028] 优选进一步导入了编码通过非甲羟戊酸途径发生作用的至少一种酶的核酸，该核 酸在宿主细胞内进行表达。
[0029] 通过该构成，基于非甲羟戊酸途径的IPP合成能力得到增强。其结果，本发明的重 组细胞的异戊>條生广能力进一步提尚。
[0030] 优选所述非甲羟戊酸途径为宿主细胞以外的非甲羟戊酸途径。
[0031 ] 优选所述异戊二烯合成酶为植物来源。
[0032] 优选编码所述异戊二烯合成酶的核酸编码下述（a)、（b)或（C)的蛋白质。
[0033] (a)包含序列号2所表示的氨基酸序列的蛋白质；
[0034] (b)包含序列号2所表示的氨基酸序列中1~20个氨基酸发生了缺失、置换或者 添加的氨基酸序列、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质；
[0035] (c)具有与序列号2所表示的氨基酸序列显示出60%以上的同源性的氨基酸序 列、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质。
[0036] 优选导入宿主细胞中的核酸的密码子被改变。
[0037] 通过该构成，可以在宿主细胞内更有效地表达所导入的核酸（外来基因）。
[0038] 优选导入至宿主细胞中的核酸被组入宿主细胞的基因组中。
[0039] 优选导入至宿主细胞中的核酸被组入质粒中。
[0040] 本发明的另一方式为一种异戊二烯的生产方法，该生产方法利用选自由一氧化 碳、二氧化碳、甲酸和甲醇组成的组中的至少一种Cl化合物作为碳源，对上述重组细胞进 行培养，使该重组细胞生产异戊二烯。
[0041] 本发明涉及异戊二烯的生产方法。本发明中，将选自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸 和甲醇组成的组中的至少一种Cl化合物作为碳源，对上述重组细胞进行培养，由此使该重 组细胞生产异戊二烯。根据本发明，可以由包含一氧化碳或二氧化碳的合成气、或者甲酸、 甲醇生产异戊二烯。
[0042] 本发明的另一方式为一种异戊二烯的生产方法，该生产方法使选自由一氧化碳、 二氧化碳、甲酸和甲醇组成的组中的至少一种Cl化合物与上述重组细胞接触，在该重组细 胞中由所述Cl化合物生产异戊二烯。
[0043] 本发明中，使选自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇组成的组中的至少一种Cl 化合物与上述重组细胞接触，由该Cl化合物生产异戊二烯。根据本发明，也可以由包含一 氧化碳或二氧化碳的合成气、或者甲酸、甲醇生产异戊二烯。
[0044] 优选将以一氧化碳和氢气为主要成分的气体、或者以二氧化碳和氢为主要成分的 气体提供至所述重组细胞。
[0045] "将气体提供至重组细胞"是指，以碳源等的形式将气体提供至重组细胞、或者使 气体与重组细胞接触。
[0046] 优选重组细胞以梭菌（Clostridium)属细菌或穆尔氏菌（Moorella)属细菌作为 宿主细胞，并回收被释放到重组细胞的细胞外的异戊二烯。
[0047] 也可以利用碳酸氢盐代替二氧化碳。
[0048] 发明的效果
[0049] 利用本发明的重组细胞，可以由一氧化碳、二氧化碳、甲酸或甲醇生产异戊二烯。 例如，可以由包含一氧化碳或二氧化碳的合成气生产异戊二烯。
[0050] 关于本发明的异戊二烯的生产方法也同样，可以由一氧化碳、二氧化碳、甲酸或甲 醇生产异戊二烯。
【附图说明】
[0051] 图1是表示乙酰CoA途径和甲醇途径的说明图。
[0052] 图2是异戊二烯标准物品的气相色谱。
[0053] 图3是保持对照载体pSCiOl质粒的永达尔梭菌（C. Ijungdahlii)的合成气发酵 气相成分的气相色谱。
[0054] 图4是保持pSCi : : idi-ispS质粒的永达尔梭菌（C. Ijungdahlii)的合成气发酵 气相成分的气相色谱。
[0055] 图5是表示质粒pSCi: :MVA-IspS_idi的异戊二稀合成基因簇的构成的说明图。
[0056] 图6是保持质粒pSCi : :MVA-IspS_idi的永达尔梭菌（C. Ijungdahlii)的合成气 发酵气相成分的气相色谱。
【具体实施方式】
[0057] 本发明的方式之一的重组细胞将编码异戊二烯合成酶的核酸导入具有基于非甲 羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸（IPP)合成能力的宿主细胞中而成，该核酸在所述宿主细胞 内进行表达，能够由选自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇组成的组中的至少一种Cl化 合物生产异戊二烯。
[0058] 本方式的重组细胞中的宿主细胞具有"基于非甲羟戊酸途径的IPP合成能力"。
[0059] 如上所述，通常IPP的合成途径大致分为甲羟戊酸途径（MVA途径）和非甲羟戊酸 途径（MEP途径）这两种。甲羟戊酸途径是真核生物所具备的，将乙酰CoA作为起始物质。作 为通过甲羟戊酸途径发生作用的酶，从上游起依次可以举出乙酰CoA乙酰