脊椎动物dna甲基转移酶的dna5-甲基胞嘧啶去甲基活性的制作方法
【专利说明】脊椎动物DNA甲基转移酶的DNA 5-甲基胞嘧啶去甲基活性 技术领域
[0001] 总体而言，本发明是关于DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性，及其治疗与诊断的用 途。 【背景技术】
[0002] 在脊椎动物中，DNA甲基化主要发生在CpG二分体内的胞喃啶（cytosine，C)的 5-位置，且其基因组甲基化模式是由该DNA(C-5)-甲基转移酶（或称DNMTs)所建立/维 持。在已知的脊椎动物DNMTs中，DNMTl显现出对半甲基化DNA的底物偏好，且维持了在 DNA复制期间的甲基化模式。在体外，DNMT3A与DNMT3B对未甲基化以及半甲基化的DNA 显现出相等的C-5甲基化活性，且其对于起始性基因组DNA甲基化（de novo genomic DNA methylation)与早期胚胎的发育是不可或缺的。包含上述三种必要的DNMTs的脊椎动物 DNA甲基化系统对基因组DNA甲基化模式的全面与局部建立是不可或缺的，因此对基因表 达、神经可塑性、分化、致癌、印迹（imprinting)、X染色体去活化及发育的过程也是不可或 缺的。
[0003] 在2012年以前的文献中对于脊椎动物中是否存在可以主动且直接地在DNA上将 5-mC转换为C的酶仍是未知。
【发明内容】
[0004] 在一方面，本发明涉及一种用于鉴定测试试剂（或化合物）为DNA甲基转移酶的 活化DNA去甲基活性的调节物的方法。该方法包括：
[0005] a)提供甲基化DNA ;
[0006] b)提供DNA甲基转移酶；
[0007] c)在测试药剂存在或不存在下，使该甲基化DNA与该DNA甲基转移酶反应一段足 够的时间，以进行去甲基反应并产生去甲基DNA产物；
[0008] d)分析去甲基反应的程度；以及
[0009] e)比较在该测试试剂存在与不存在下的去甲基反应的程度，从而由此将该测试药 剂鉴定为该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物；
[0010] 其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试试剂被鉴定为该 DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存 在下较高时，该测试药剂被鉴定为该DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的刺激剂。 [0011] 于本发明的一个具体实施例中，该分析步骤是通过选自由限制酶切-聚合酶连锁 反应（restriction digestion-polymer chain reaction，PCR)分析、水解-薄层色层分 析、以抗体为基础的分析、闪烁计数、放射摄影术、斑点印迹（dot blotting)、以液相层析为 基础的分析以及以亚硫酸氢钠为基础的分析所组成的群组的技术以进行。
[0012] 于本发明的另一个具体实施例中，该去甲基反应在约为10 μΜ至IOmM的妈离子存 在下进行。
[0013] 于本发明的另一个具体实施例中，该DNA甲基转移酶为分离的脊椎动物DNA甲基 转移酶或重组的DNA甲基转移酶，或存在于核萃取物中或存在于细胞萃取物中。该脊椎动 物DNA甲基转移酶、该核萃取物，或该细胞萃取物由选自于由脊椎动物细胞培养、脊椎动物 组织、昆虫细胞、虫细胞、昆虫组织、虫组织、植物细胞、植物组织、酵母菌细胞，以及细菌细 胞所组成的群组的细胞制备。其中该核萃取物可为精子萃取物。
[0014] 在本发明的另一个具体实施例中，该甲基化DNA包含经标记的甲基基团。所述甲 基化DNA内的该甲基基团可为经放射性标记。
[0015] 于本发明的另一个具体实施例中，前述方法的步骤（a)至（d)包含下列技术特征： 其中，
[0016] (a)在步骤（a)中所提供的该甲基化DNA为可操作地连接于组成型启动子的甲基 化报道基因且存在于细胞内；
[0017] (b)在步骤（b)中所提供的该DNA甲基转移酶为可操作地连接于组成型启动子且 也存在于该细胞内，或内生地存在于该细胞内，作为内生的DNA甲基转移酶；
[0018] (c)在步骤（c)中所产生的该去甲基DNA产物为去甲基化报道基因，其在该细胞内 表达报道蛋白；以及
[0019] (d)该分析步骤通过选自于由下列所组成的群组的技术以进行：
[0020] (i)分析在该细胞中由该去甲基化报道基因所编码的报道蛋白的信号；
[0021] (ii)以蛋白质印迹法（Western blot)分析该报道蛋白的表达；以及
[0022] (iii)分离该甲基化与去甲基化报道基因并通过限制酶切-聚合酶连锁反应 (PCR)分析、水解-薄层色层分析、以抗体为基础的分析、闪烁计数、放射摄影术、斑点印迹、 以液相层析为基础的分析以及以亚硫酸氢钠为基础的分析以分析去甲基反应的程度。
[0023] 于本发明的一个具体实施例中，该甲基化报道基因与该DNA甲基转移酶是经由转 染作用存在于该细胞内。或可选择地，该DNA甲基转移酶为存在于该细胞内的内生的酶。
[0024] 该甲基化报道基因转染该细胞，且该DNA甲基转移酶可为转染至该相同细胞内的 外源的酶或已经存在于该相同细胞内的内生的酶。于一个具体实施例中，该甲基化报道基 因与该DNA甲基转移酶共转染至该细胞内。
[0025] 于本发明的一个具体实施例中，该测试药剂被导入该细胞内或加入浸泡该细胞的 培养基中。
[0026] 于本发明的另一个具体实施例中，该甲基化报道基因包含选自于由荧光蛋白编码 基因、荧光素酶基因、抗药基因以及细胞存活的基因所组成的群组的基因的DNA序列。
[0027] 于本发明的另一个具体实施例中，该甲基化DNA包含5-甲基胞嘧啶 (5_methylcytosine，5mC)的 DNA。
[0028] 于本发明的另一个具体实施例中，步骤（C)是于无还原剂的环境下或于非还原的 环境下进行。
[0029] 该DNA甲基转移酶可为野生型DNA甲基转移酶的修饰形式，所述修饰形式保留该 野生型DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性。
[0030] 该DNA甲基转移酶可选自于由DNA甲基转移酶I、DNA甲基转移酶3A、DNA甲基转 移酶3B及其任何组合所组成的群组。
[0031] 该组成型启动子可为，但不限于，巨细胞病毒（cytomegalovirus)启动子。
[0032] 于另一方面，本发明关于一种将测试药剂鉴定为DNA甲基转移酶的活化DNA去甲 基活性的调节物的方法，其中该方法包括：
[0033] (I)
[0034] a)在测试药剂存在或不存在下，将含有甲基化DNA的第一组合物与含有该DNA甲 基转移酶的第二组合物混合；
[0035] b)经由将该甲基化DNA与该DNA甲基转移酶反应一段足够的时间而使去甲基反应 发生，以产生去甲基化DNA产物；
[0036] c)分析去甲基反应的程度；以及
[0037] d)比较在该测试药剂存在与不存在下该去甲基反应的程度，从而由此鉴定该用于 调节该DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的测试药剂；
[0038] 其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试药剂被鉴定为该 DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存 在下较高时，该测试药剂被鉴定为该DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的刺激剂；
[0039] 或者（II)
[0040] 1)提供含有经甲基化且可操作地连接于组成型启动子的报道基因转染的细胞的 细胞培养基，该细胞含有内生的DNA甲基转移酶或外源地表达野生型、修饰的或基因工程 改造的DNA甲基转移酶；
[0041] 2)将该细胞暴露于测试药剂；
[0042] 3)使去甲基反应发生，以产生去甲基报道基因，其在该细胞内表达报道蛋白；以 及
[0043] 4)通过检测在该细胞中该去甲基报道基因表达的该报道蛋白的信号强度，以分析 该报道基因的去甲基反应的程度；
[0044] 5)比较在该测试药剂存在与不存在下，该报道基因的去甲基反应的程度，从而由 此将该测试药剂鉴定该作为该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物；
[0045] 其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试药剂被鉴定为该 DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存 在下较高时，该测试药剂被鉴定为该DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的刺激剂。
[0046] 该野生型DNA甲基转移酶可选自于由DNA甲基转移酶UDNA甲基转移酶3A，以及 DNA甲基转移酶3B所组成的群组。
[0047] 【附图说明】本发明的一个或多个具体实施例，且与文字说明一起，用于解释本发明 的原理。只要有可能，相同的组件符号是用于整个附图中，以指具体实施例的相同或类似的 组件。 【附图说明】
[0048] 图1显示该哺乳类DNMTs的DNA 5-mC去甲基活性。该含有5-mC的DNA底物在 含有IOmM CaClJ^缓冲液B中的293T核萃取物中进行反应，各核萃取物各自含有：外源 表达的EGFP(第1道与第2道）、小鼠 DNMTl (第3道与第4道）、DNMT3A(第5道与第6 道）、DNMT3B (第7道与第8道）、及其定点突变（第9-14道）。5-mC转换为C的程度是以 水解-TLC分析法进行分析，且其定量显示于该直方图中。在第4、6、8道中该外源野生型酶 的量分别相似于在第1〇、12、14道中该突变酶的量（未显示蛋白质印迹数据）。M代表未反 应的模拟对照组；R代表有进行反应者。误差条显示为S.D.。*代表p〈0. 05,是以t-检验 (t-test)将第4、6、8条与第2条比较。
[0049] 图2A显示重组DNMTs的DNA 5-mC去甲基活性的钙依赖性。以重组DNMT3B将5-mC 转换为C的水解TLC分析。该重组小鼠 DNMT3B的DNA去甲基活性的分析是通过将含有40nM 5-mC 的 DNA 底物与 40nM 的酶在含有 100 μ g/ml BSA 与递增浓度（0、10 μ M、100 μ M、ImM、5mM 及IOmM)的CaCl；^缓冲液B中进行反应。所有反应均在37°C下进行4小时。量化结果呈 现于直方图中。M代表未反应的模拟对照