获得并检测待鉴定对象之标志物的方法、相关标志物、认证方法以及验证方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别地涉及分子生物学并且涉及获得标志物的方法，所述标志物用于鉴定包含至少一个DNA片段且优选多个多态性DNA片段(例如微卫星(STR)或单核苷酸多态性(SNP))的对象以用于司法目的等用途，对它们的三维结构进行修饰，吸附至对拉曼辐射有活性的金属纳米颗粒并进行微囊化。一种通过分子生物学技术进行检测/即时认证(autenticaci0n instantanea)和后续鉴定的方法，其总体上涉及包括十个级别(niveles)的安全系统。
[0002]本文还保护所获得遗传标志物的检测方法，对用所述方法标记的对象进行即时认证的方法；以及验证(verificar)标记的对象的方法和将标志物并入到待鉴定对象的方法。
[0003]提及的组成(componente)可选自多种等同物，而不会偏离本文中阐述的本发明原理。
【背景技术】
[0004]长久以来一直试图找到可为日常交易提供更高安全性的新的要素、用品(disposic1nes)和机制。
[0005]自古以来，人类已经尝试使用经改良为并入导致难以复制之要素的文件来防止盗窃、欺骗和伪造。用获自不同模具的特殊图形进行密封实现了早期的期望，但印刷方法很快就发生了改变。已经克服了并入新的技术进步的安全特征并出现的质量仪器。
[0006]当从银行支票擦去数值并重新填写更高的数值时，这对抗(opuesto) 了纸的标记。
[0007]一般而言，伪造的纸币和文件已导致采用特殊的纸张和墨(tinta)(光学墨)，在纸张基体、半透明的保护膜等中并入安全要素。
[0008]本发明人意识到对每个人而言特定的要素。指纹是这种情况，而DNA也是这种情况。
[0009]事实上，每个个体均具有生物学痕迹，这是独特的并且当前的技术可以绝对确定性对其进行鉴定。
[0010]虽然这是正确的，但是本发明人清楚地知晓，为准确阳性鉴定向对象并入生物完整的DNA分子将很容易被伪造者利用；因为这将足够接近这样DNA的拥有者并从其获得生物样品。
[0011]事实上，头发、沉积在玻璃上的唾液、一滴血液甚至是一点皮肤将足以获得添加到伪造对象所需的DNA ;然后，它将明显地看起来是真的。
[0012]发明人在文件200020102319 AR中已经预见到了这点，其导致US 10/307012和EP33801366的出现；它们被认为是本文件主题的最接近现有技术。
[0013]事实上，考虑到所述可能性，本发明人在上述文件中已公开了待鉴定对象应标记有至少一个特定的多态性DNA片段。
[0014]对于伪造者而言，仅使用一个多态性DNA片段不足以获得完整的DNA，因为他必须知道哪个是所使用DNA的选定片段(或片段的组合)。然而，这有数十亿种可能的组合，伪造者几乎不可能偶然地使用到用户选择的组合，因而得到了一种高效遗传标志物。
[0015]虽然所引用文件涵盖的标志物是高效的，但是本发明人发现计算机的处理能力允许每秒数百万次的操作，这增加了伪造者的机会。
[0016]如在引用文件中所公开的，本发明人知晓检测用作对象之标志物的DNA片段需要并不是在所有实验室均可得的高技术基础设施；所以对多态性DNA片段之检测方法的简化会扩展这种类型标志物的使用。此外，任何分子学科学家都应认识到，尽管想要进行伪造的实验室可能对于这些技术而言非常专业，但是除非预先知晓精确的核苷酸序列，否则无法复制本文中详述的这样的多态性片段(STR/SNP);因为实验室检测所需的试剂(引物)是基于该知识而制备的。
[0017]鉴于对所公开内容这样的观察结果，本发明人已经确定本发明的一个目的是获得由存在于自然界的任何生物之多态性DNA片段形成的标志物。
[0018]这意味着，可以从人类以及动物、植物、微生物或病毒获得待使用的片段。
[0019]为获得本文件中所公开的标志物，使用从所有这些物种获得的不同多态性DNA片段的组合是很方便的。
[0020]为了通过拉曼光谱进行即时检测并且也为了提高标志物的复杂度(这有助于避免伪造)，本发明人已对此类多态性片段的三维结构进行了几何修饰，然后使其吸附到纳米金属颗粒上。
[0021]这种更高的复杂度防止伪造者披露标志物的结构，尤其是当其与所用的STR和SNP的相对浓度和绝对浓度整合在一起时。
[0022]本发明的第二目的是获得允许对标记的对象实时进行检测和即时认证的方法和
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[0023]本发明的第三目的是获得包括多个安全级别的方法；伪造者需跨过这些安全级别从而复制这样的遗传标志物。
[0024]脱氧核糖核酸(DNA)是存储特定个体遗传信息的大分子。
[0025]DNA的三维几何结构是双螺旋，可以观察到大沟和小沟。前者深且宽，而后者浅且窄。
[0026]本发明人知晓有分子(例如蛋白质)，通过称为氢键的特异性结合和称为范德华(Van der Waals)相互作用的非特异性结合以及其它静电相互作用与DNA沟的内部相结合。
[0027]在蛋白质的情况下，它们识别氢键和甲基(疏水的)的供体和接纳体，这些后者专用于大沟。
[0028]如图1所示，在大沟中有四种可能的识别模式，而在小沟中仅有两种。
[0029]我们知晓一些分子通过大沟与DNA结合，而另一些分子在小沟结合，然而另一些连接到大沟和小沟两者。
[0030]在该第三情况下，所述事件致使DNA分子去稳定。
[0031]同一物种的所有生物共有许多相同的DNA片段但也有不同的其他部分。这些不同的部分被称为“多态性片段(fragmentos polim0rficos) ”，其被定义为存在于特定染色体基因座中具有不同的核苷酸序列或具有可变数目的串联重复的两种或更多种形式(等位基因)。
[0032]多态性片段有数百万，从而使得存在于自然界的每个生物都是独特的。
[0033]这些多态性DNA位点可能最终被用于司法鉴定目的。
[0034]一些多态性DNA片段表现出串联长度的变化，例如小卫星(VNTR)和微卫星(STR)，这取决于存在于重复核心序列中的核苷酸数目；然而另一些则表现出序列组成的变化，例如单核苷酸(SNP)的不同。
[0035]任何多态性DNA片段都有两个等位基因变体，每个从一个亲本继承而来。
[0036]对于STR，等位基因变体以平均数字范围7至15存在；然而SNP在每个基因座只有两个等位基因变体。
[0037]然而，即使区分度低于STR，但SNP具有在基因组中以数百万的量存在的巨大优势；它们负责生物的表型特征以及其他功能。
[0038]总之，每一个生物都是独特的，因而与这个星球上任何其他的生物不同。在自然界中这种多样性取决于DNA的多态性位点，例如微卫星(STR)和单碱基多态性(SNP)。
[0039]在提到的文件和本文中使用了 STR和SNP ;首先是因为通过PCR扩增方法进行分析和检测的可行性，其次是因为在自然界存在的所有生物中有数百万可供选择。
[0040]已经陈述了本发明的一个目的是多态性片段的即时检测，为此本发明人使用拉曼光谱技术并且优选提供了最灵敏方法之一的SERS拉曼(表面增强拉曼光谱)，用定量和无损的材料分析定性分析。该应用是指通过SERS拉曼检测，0.9nM(纳摩尔)STR/SNP，最小检测体积100-150飞升的溶液，其含有至少60个分子的STR。
[0041]拉曼光谱类似于红外光谱且由对应于所分析样品之特定分子振动的带的波长分布组成。
[0042]因此，当分析发射拉曼光谱时，观察到的对应于波长的峰是每种分析物的分子化学结构和组成的表征；同时样品中由分子散射的拉曼光的强度取决于其浓度。
[0043]在实践中，拉曼分光镜包括光源，通常被聚焦在样品上产生非弹性散射辐射的激光(其被光学收集并引导到选择波长的分光光度计)，其中检测器将打印光子的能量转换成电信号强度。利用SERS技术，拉曼信号可以增加16-1O14倍，使得其有可能实现允许进行单分子检测的灵敏度。
[0044]对于最大的灵敏度，在选自金、银、钼和铜中至少一种金属的纳米颗粒中引起多态性STR片段和/或SNP的吸附，其中所述纳米颗粒尺寸在5至200nm的范围内变化。实现了这样的灵敏度增加是因为形成10纳米数量级的粗糙表面的金属颗粒，其与入射辐射的波长相比较小。小的颗粒尺寸(最好在50至10nm)使得能够激发金属并提高检测其表面吸附的DNA的灵敏度。
[0045]我们进行了几个文件的证明以确定文件号CN1302905涉及含有金属离子DNA的防伪造材料，其是通过混合具有高配位力的可溶性金属盐的水溶液以及DNA和醇的溶液而制备的，以获得添加有用于标记或印刷墨之明胶、糊精、可溶性淀粉的水溶液或树胶的M-DNA倾析水溶物。
[0046]文件N0.US2008/0189066涉及用于认证已经标记有不同的片段SNP或STR的对象之拉曼分光镜的使用和修改。
[0047]对于上面提到的文件，应注意的是未加修改而获得了检测的片段；也就是说，选择是天然存在的。
[0048]文件N0.US20030235836涉及多态性STR片段或微囊化SNP的用途，其用于标记在实验