旋转性隔离的翻译元件的制作方法
【专利说明】旋转性隔离的翻译元件
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2013年1月18日提交的美国临时申请 61/754, 339号的优先权，并根据35 U. S. C. § 120要求2013年3月13日提交的美国临时 申请13/801，762号的优先权，通过引用将每篇申请的内容整体合并至本文中。
【背景技术】
[0003] 以分子来制造纳米级计算机具有很大的发展潜力，部分原因在于这种计算机可很 好地解决某些计算问题。特别地，使用生物分子的计算机能够与生物学环境相容，使得它们 能够用于复杂疾病的诊断，甚至治疗。
[0004] 将一种核酸序列翻译成另一种核酸序列的能力基本上使人们能够利用核酸建立 逻辑门和网络。这些门和网络通过两个事件驱动，即杂交和链置换，这两者通常是热动力学 上有利的，即它们涉及从较高能量状态到较低能量状态的转变。因此，两个事件可在系统内 自发进行。
[0005] 杂交涉及核酸的游离的单链片段。因此，可通过这些游离片段的可获得性来调节 核酸网络。
[0006] "隔离事件（sequestering event) "允许某些序列有条件地用于网络的其余部分。 这些事件赋予了翻译元件（translators)的构造，翻译元件将一个单链核酸序列转化为一 个不同的单链核酸序列。这些翻译元件是利用核酸建立基本逻辑算子的基础，这些基本逻 辑算子例如是与（AND)、非（NOT)、或（OR)、与非（NAND)、或非（NOR)和异或非（XNOR)。通过 这些以及其他逻辑组件，可以建造包括例如放大元件的组件的较大网络。因此，这些翻译事 件对于利用核酸的信息处理以及分子计算是重要的。
【发明内容】
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明提供一种组合物，其包含第一核酸复合物和第 二核酸复合物，每一个均包含第一、第二、第三和第四核酸链，每个核酸链按顺序包含第 一、第二和第三片段，其中第一复合物的第一、第二、第三和第四链的核酸链分别被定义为 B-X-D，万-7-：^和？-￥-(：，第二复合物的第一、第二、第三和第四链分别被定义 为CU, E-Y-D，F-Z-G，F-Z-互，其中每个字母表示一个片段，每个以连接的一 串字母表示一个链，并且其中：第一复合物和第二复合物的每一个都包含形成在第一链的 第二片段和第二链的第二片段之间的第一双链区（在第一复合物和第二复合物中分别为 X::Z和F::Y )，形成在第三链的第二片段和第四链的第二片段之间的第二双链区（Y::F 和Z::Z )，形成在第一链的第三片段和第三链的第一片段之间的第三双链区（D::D和 F::F )，以及形成在第二链的第一片段和第四链的第三片段之间的第四双链区（C::C和 E左）；在第一复合物和第二复合物中的每一个中，第一链的第一片段（在第一复合物和 第二复合物中分别为B和C )、第二链的第三片段（Z和D)、第三链的第三片段（亙和G) 以及第四链的第一片段（F和F )是单链的；第一复合物的第三链（万-F-Z )具有与第二 复合物的第二链（E-Y-D)适当的序列互补性，从而允许它们之间在杂交条件下结合；并且 第一复合物的第四链（F-Y-C)具有与第二复合物的第一链（C-F-F)适当的序列互补性， 从而允许它们之间在杂交条件下结合。
[0008] 在一个方面，该组合物进一步包括第三核酸复合物，该第三核酸复合物包含第一 和第二核酸链，每个链按顺序包括第一片段、第二片段和第三片段，其中第一链和第二链 分别被定义为E-Z-H和G-Z-戸，其中该第三核酸复合物包含形成在第一链的第二片段和 第二链的第二片段之间的双链区（Z ::Z)，并且第一链的第一片段（E)和第二链的第三片 段（F)是单链的，并且其中：第二复合物的第三链（F-Z-G)具有与第三复合物的第二链 (疗-Z-F)适当的序列互补性，从而允许它们之间在杂交条件下结合；第二复合物的第四 链（互-Z-亙）具有与第三复合物的第一链（E-Z-H)适当的序列互补性，从而允许它们之间 在杂交条件下结合。
[0009] 在一些方面，第一复合物的第三链的第三片段（Z )与第三复合物的第一链的第 一片段（E)具有序列互补性，但在正常杂交条件下，由于对这两个片段的任何一个或两个 进行化学修饰而使彼此不会稳定结合；并且第一复合物的第四链的第一片段（F)与第三复 合物的第一链的第三片段（F )具有序列互补性，但在正常杂交条件下，由于对这两个片段 的任何一个或两个进行化学修饰而使彼此不会稳定结合。
[0010] 适于本发明技术的化学修饰包括，但不限于，以结合了 mini-PEG的丝氨酸来源的 γ -PNA替换核酸片段的糖-磷酸二酯骨架。在一些方面，化学修饰包括用三环胞嘧啶类似 物取代核酸片段中的至少一个核苷的含氮碱基。在一个方面，化学修饰包括在核苷酸的糖 基部分的2'位置引入杂原子。
[0011] 这些复合物的图示及其相互关系见图6Α，其中翻译元件102对应于第一复合物， 翻译元件103对应于第二复合物，翻译元件104对应于第三复合物。类似地，图10-13、14A-D 和15-16也图示了本发明范围内的翻译元件（核酸复合物），包括每个单独的翻译元件以及 它们的作为翻译元件群组形式（或组合物形式）的组合。
[0012] 在一个方面，每个片段的长度为约5个碱基至约50个碱基。在另一个方面，每个 单链片段的长度为约5个碱基至约30个碱基。
[0013] 在本发明的范围内，每种组合物可进一步任选地包含药学上可接受的载体。本发 明的一些实施方式进一步提供一种包含本发明的组合物或复合物的细胞。
[0014] 本发明还提供适于模拟、设计、记录、报道或分析本发明公开的技术的某些方面的 计算机执行的方法以及非瞬时性计算机可读介质。
【附图说明】
[0015] 附图作为本发明的实施方式来提供，仅作为举例图示，并非作为限制。
[0016] 图IA图示核酸翻译元件的固相隔离实施方式，其中单个区段（A、B等）代表任意 长度和序列的寡核苷酸片段。
[0017] 图IB图示核酸翻译元件的固相隔离实施方式如何隔离寡核苷酸片段。
[0018] 图2A图示核酸翻译元件的"立足点（toe-hold)"隔离实施方式。同样地，单个区 段代表任意长度和序列的寡核苷酸片段。
[0019] 图2B图示图2A中所示的立足点隔离实施方式如何隔离寡核苷酸片段。
[0020] 图3A显示包含三个立足点隔离的核酸翻译元件的系统。所显示的反应都是链置 换反应，都通过图2A所示的分支迀移机制进行。
[0021] 图3B显示具有与图3A中所示的寡核苷酸相同的寡核苷酸系统，但不具有链置换 反应，而是显示立足点"碰撞"，其中立足点被不能产生链置换反应的序列结合。这种结合事 件占据了立足点，使得期望的链不能结合。
[0022] 图 4a-b 显示 37°C 时 PBS 缓冲液（137mM NaCl, 2. 7mM KC1, IOmM Na2HPO4, I. 76mM KH2PO4, pH 7.4)中具有立足点（a)或不具有立足点（b)时的交换反应。利用标准曲线将荧 光信号转化为浓度。a)50nM[F-(A 24)::(X7)-Q]〇双链与lOIOOnMKDL滴定液（IOnM的增 量）孵育（蓝色变红色），通过荧光共振能量转移法（FRET)监测游离[F-(A 24)],的浓度。 b)50nM [F-(A24)::(0Q]0 双链与 l〇-2〇〇nM [(A24)::U^)]〇 滴定液（IOnM 的增量）（从低到 高）混合，[Ρ-(Α24)::(Χ^)；Κ的浓度通过FRET监测。
[0023] 图5显示用于设计翻译元件的立足点交换法。
[0024] 图6Α-6Β图示旋转隔离系统中使用的核酸复合物（翻译元件）。
[0025] 图7显示核酸类似物的经修饰的骨架结构，其中"Β"代表任意核碱基，（a)显示在 DNA中发现的天然磷酸二酯骨架，（b)显示肽核酸，（c)显示胍基肽核酸，（d)显示L-丝氨 酸来源的γ-ΡΝΑ，（e)显示二酰胺基磷酸酯（在本文中具有吗啉代糖），（f)和）g)显示结 合了 mini-PEG的丝氨酸来源的γ-ΡΝΑ。
[0026] 图8图示了核酸类似物的经修饰的糖结构，其中"Β"代表任意核碱基，（a)显示在 DNA中发现的天然脱氧核糖，（b)显示吗啉基，（c)显示锁核酸，（d)显示氟修饰的RNA衍生 物。
[0027] 图9图示核酸类似物的经修饰的核碱基结构，（a)甲基胞嘧啶，（b)二氨基嘌呤， (c)吩恶嘆，（d)G形夹。
[0028] 图 10 示出 mRNA 适配元件（adaptor)。
[0029] 图11显示RNAi适配元件。
[0030] 图12图示反义适配元件。
[0031] 图13显示扇入翻译元件群组。
[0032] 图14A-14D示出四个扇出翻译元件群组。这些群组中的两个产生两个或更多个相 同的翻译元件，因此起到扩增元件的作用（A和B)，而另外两个群组产生两个或更多个不同 的下游翻译元件（C和D)。
[0033] 图15图示一个复合条件性翻译元件群组。
[0034] 图16显示一个反相元件（inverter)。
[0035] 图17A-M图示旋转隔离翻译元件（RST)网络和立足点隔离翻译元件（THST)网络 关于前景信号和背景信号的模拟结果，其中使用了不同尺寸的立足点，尺寸范围为3个核 苷酸（nt)至15nt (如图所示）。所有模拟都以IOOnM翻译元件进行3个阶段。
[0036] 图18A-D显示RST网络和THST网络在不同网络深度（即涉及的翻译元件/阶段 的数量，如图所示）时的模拟结果。所有模拟均以8-nt立足点在IOOnm翻译元件浓度处进 行。
[0037] 图19A-N显示以中等大小网络（5个阶段）进行的长立足点（13nt)和短立足点 (8nt)的模拟结果，并且显示网络行为如何随着所示的翻译元件的浓度的改变而变化。
[0038] 某些附图或全部附图都是示例性的图示，因此它们不必然示出所示元件的实际相 对尺寸或位置。附图仅为了说明一个或多个实施方式的目的而提供，应当明确理解的是它 们不能被用来限制本发明的范围。
【具体实施方式】
[0039] 固相隔离、立足点隔离和立足点交换等多种方法可被用来翻译核酸序列，从而建 立逻辑算子和网络。以下更详细描述的这三种具体方法通过利用三程（three-way)、立足点 介导的分支迀移反应的几何学得以示例。然而，对于分支迀移反应，其他机制也是可能的， 包括但不限于，四程分支迀移、四程加速迀移和多链复合物迀移。
[0040] 因此，虽然为了说明目的以下所述实施方式利用了三程分支迀移，但是本发明预 期到DNA逻辑门和网络被建立以利用其它分支迀移途径。相反，本发明的实施方式可被应 用于任何分支迀移反应。
[0041] 在说明书和附图中，大写字母，例如A、B、C、X、Y、Z(任选地具有下标或上标）， 被用来表示任意长度的寡核苷酸的片段。相应的A'、B'、C'、X'、Y'、Z'，或可互换使用的 I、亙、C、X、F、Z表示各自的反向互补序列。
[0042] 术语"寡核苷酸"、"多核苷酸"和"核酸"包括所有形式的核酸分子。该类别包括， 但不限于，核糖核酸（RNA)、脱氧核糖核酸（DNA)、肽核酸（PNA)及其衍生物，分别可具有和 不具有修饰。
[0043] 固相隔离
[0044] 固相隔离通过珠、纳米颗粒或表面将空间内的相关序列/链物理性隔开。这种方 法利用了位点分离的原理，其广泛应用于有机化学中。固相隔离几何学中的这些置换事件 的发生时序可通过调节所需的链是处于系统的溶液相还是固相中而受控制。
[0045] 图IA显示翻译元件的基本固相隔离装置，翻译元件是允许系统将一种核酸序列 替换为另一种核酸序列的组件。对于链A' -X'，A和X的每一个代表任意长度和序列的一 段寡核苷酸，X'和A'代表它们各自的反向互补序列。链A' -X'结合至固体载体并且最初 与Y-B-X杂交，形成不完全碱基配对双链体形式的核酸结构，其可用作翻译元件。在该构造 中，链Y-B-X是被固相隔离的，因此不能与系统的其余部分相互作用。但是，在链X-A (也称 为多核苷酸置换分子）的存在下，链Y-B-X可从固体载体被置换出来并暴露于系统的溶液 相，而链X-A被结合至载体。该操作包括两个步骤：第一个步骤是互补序列A和A'的杂交 (通常称为"立足点结合"）。在第二个步骤中，链X-A的X区结合至链A' -X'的X'区，置 换Y-B-X的X区，并将该链释放到溶液中，而让X-A与固体载体结合（该步骤通常称为"分 支迀移反应"）。这个两步骤程序有效地将游离X-A链翻译成游离Y-B-X链。
[0046] 图IB显示的系统具有输入链X-A，其与不完全碱基配对的双链体（"翻译元件1"） 相互作用。输出包括完全碱基配对双链体A' -X' /X-A(被认为是"废"产物），以及输出链 Y-B_X(被称为"输出1"并且可被作为进一步反应中的"输入2"）。"输入2"与"翻译元件 2"相互作用，从而产生"输出2"和另一种废产物。在该图中，链Y-B-X的B区图示序列在 该网络中的隔离。开始时，Y-B-X不能与翻译元件2的B'区杂交，因为两者被分离在单独 的固体载体上。当输入1结合至翻译元件1并释放Y-B-X到溶液中时，Y-B-X随后可与翻 译元件2相互作用。因此，Y-B-X和翻译元件2相互作用的能力取决于输入1的存在。
[0047] 由于位阻效应，结合至一个固体表面的链与结合至另一固体表面的链极其缓慢地 相互作用。因此，溶液相中的链是能够与固相算子相互作用的唯一组件。
[0048] 立足点隔离
[0049] 立足点隔离与固相翻译元件实现相同的操作，但通过将多段序列保持结合在双链 体中而起作用。正如在固相翻译元件中一样，置换事件可游离出感兴趣的序列。所有链都 可以共同在溶液中，其结果是，置换时间通过立足点的可获得性而被调节。术语"立足点"在 本文中是指提供置换事件的起点的单链核酸序列的短片段。
[0050] 图2A显示立足点隔离的翻译元件，其类似于图IA中的翻译元件，但是其基于立足 点隔离而非固相隔离。在该实施例中，翻译元件的A'区是立足点，其结合输入链并允许链 置换反应进行。
[0051] 图2B显示基于立足点的系统，其具有与不完全碱基配对双链体"翻译元件1"相