基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置及其在增强靶标响应性中的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿 装置及其在增强靶标响应性中的应用方法。
【背景技术】
[0002] 细胞的体外培养是生命科学基础研宄、组织工程、药物筛选和毒物评价以及细胞 生物传感器构建等的重要研宄内容。传统的平面基底细胞培养法的局限性已经为学术界和 生物技术产业界所熟知。近二十余年，随着组织工程学、空间微重力技术、微电子技术的发 展及与生物技术的结合，细胞三维培养和细胞培养微环境的工程化构建越来越成为医学及 生物工程关注的领域。细胞微环境工程化构建的目的，其一是模拟体内三维微环境，实现组 织植入体的构建并优化组织细胞功能表型以达到组织工程或再生医学的临床应用目的；其 二是通过培养微环境设计增强放大某一表型或靶标响应性，从而为细胞工程产品的制备或 基于细胞（或组织）的药物筛选或毒物评价服务。在基于细胞的药物筛选或毒物评价中， 细胞作为传感器被培养在特定的基底上，细胞的特定成分（如受体、通道和酶等）作为特定 的靶标而与药物或毒物成分相互作用，靶标的响应性将作为药效或毒理作用的判断依据。 在这一筛选体系中，培养细胞的靶标响应质量（生理或病理相关性）及相应强度是决定筛 选效益（如前导化合物质量、假阳性率或假阴性率）以及筛选通量的最重要的因素。有鉴 于荧光检测是目前基于细胞的高通量或高内涵筛选中最为重要的检测手段，采用特定的手 段提高细胞的药物或毒物靶标质量、增强靶标的荧光响应强度成为目前相关细胞筛选体系 的重要研宄内容。例如，短暂受体电位（TRP)家族通道是体内存在于多种细胞的（钙）离 子通道，与多种信号在细胞的整合有关。在肝脏，这些通道是一些重要肝脏疾病如胆汁淤积 等药物治疗的潜在靶标。其中，TRPVl通道在众多的膜片钳研宄中被发现具有快速去敏感 化特性。然而，采用钙离子荧光记录的方法发现，在TRPVl激动剂加入后期钙离子信号响应 峰宽往往达数分钟至十分钟以上。可以预见，在这种筛选体系下的筛选效果和所得前导化 合物的质量将明显受到影响。同理，采用适当的手段，如能增强有关靶标的荧光相应幅度， 将是提高筛选速度或通量的有效途径。这里，基因工程手段可能是选项之一。然而，基因工 程方法面临改变传感器细胞遗传环境和细胞表型的缺陷，其生理/病理相关性可能受到质 疑。非基因工程的增强靶标响应性的方法具有明显的应用前景。
[0003] 按照近年有关研宄进展，细胞培养微环境构建包括以下微环境要素的控制：（1) 化学和生物化学组成；（2)空间（几何三维形式）和时间因素；（3)力学因素及基底物理 特性。其中，细胞培养基底物理特性的工程化构建是特别值得有关的研宄与开发。这是 因为，一旦某一特性基底的应用得以明确，它将很容易实现批量制备与产业化应用。在这 里，基底拓扑结构也是最容易批量制备和产业化应用的细胞培养微环境要素。在过去十余 年，已经有类似的细胞培养皿产品出现在市场上，如Glycosan公司的Extracel?水凝胶、 Invitrogen 公司的 AlgiMatrix?、Glycosan 的 Extracel?海绵、Corning 公司的 Ultra-Web 以及3D Biotek的3D Insert等。然而，这类产品的一个重要局限是未能对相关适用革巴标 范围有明确的定义或建议。目前也未见使用这类培养装置增强靶标响应质量或提高前导物 筛选效能或通量的报道。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装 置及其在增强靶标响应性中的应用方法，该培养皿的基底含微柱阵列结构，该微柱阵列结 构能支持所培养细胞的粘附及铺展，以及维持均一的细胞特性；进一步，在所建立的含微柱 阵列结构基底的培养皿上，检测离子通道的响应性，进而建立一种增强细胞离子通道靶标 响应性的检测方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，包括：细胞培养皿本体、培养皿 板盖、具有拓扑结构基底的细胞培养池、细胞培养池固定并覆盖在细胞培养皿本体上；在培 养皿板盖上设置有加药窗口，其中加药窗口位于培养皿板盖的中心；
[0007] 所述细胞培养池包括固定外框和培养孔板，所述培养孔板采用拓扑结构基底；所 述固定外框的尺寸与培养皿本体相对应，在固定外框的中部设置凹槽拓扑结构基底培养 区，所述凹槽培养区用于放置具有拓扑结构的基底，所述固定外框的边缘上还设置有培养 液进液口和培养液出液口，进液管和出液管采用可拆卸固定的方式通过进液口和出液口安 插在细胞培养池上。
[0008] 进一步，所述培养液进液口和培养液出液口在靠近培养平面的内侧设置有缓冲台 阶，以保证细胞及其生长所需营养液在腔内均匀分布。
[0009] 进一步，所述拓扑结构基底的培养孔板采用阵列排列的多个纵横相互平行的微 柱。
[0010] 进一步，所述加药窗口能够实现密封，采用紧扣的方式设置在培养皿盖板上，通过 加药窗口能够实现一次性注射式加药。
[0011] 进一步，进液管和出液管均可安装阀门，可在操作需要时开启阀门，用于进出液或 是灌流式加药。
[0012] 进一步，所述进液口与出液口设有密封垫圈。
[0013] 进一步，微柱阵列基底、细胞培养池均为透明材质结构。
[0014] 一种应用上述培养皿装置增强靶标响应性的方法，包括以下步骤：
[0015] 步骤一：培养皿的预处理：用裱衬液对所述的培养皿进行裱衬，得预处理后的培 养皿；
[0016] 步骤二：细胞靶标响应性功能的增强：将靶细胞在预处理后的培养皿中培养至少 72小时，并施以激动剂刺激得TPPVl和TRPV4钙离子通道功能响应性增强的靶细胞。
[0017] 一种应用上述培养皿装置在增强细胞钙内流响应性的方法，包括以下步骤：
[0018] 步骤一：培养皿的预处理：用裱衬液对所述的培养皿的基底进行裱衬，裱衬时间 至少为2小时，得预处理后的培养皿；
[0019] 步骤二：细胞培养：将细胞接种于经步骤A预处理后的培养皿；
[0020] 步骤三：细胞TRPV离子通道钙内流荧光响应性的增强：微柱阵列拓扑结构培养皿 中培养的细胞先经钙离子荧光染料染色后，以普通荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、孔板读 数器或其他钙离子荧光记录装置采集细胞钙离子荧光信号，在信号采集过程中施以TRPV 激动剂刺激，得钙瞬态内流的离子通道荧光响应性。
[0021] 本发明的有益效果在于：本培养皿采用采用微柱阵列型拓扑结构作为细胞培养基 底，其微柱直径为微米或纳米级，制备的微柱阵列可以达到0.1 Ocm2到Icm2的大面积范围， 达到培养皿应用的要求，其生产成本低，操作简单；本培养皿不仅增强细胞TRPVl和TRPV4 在mRNA和蛋白水平的表达，而且增强上述两种通道在激动剂作用下的荧光响应强度。在培 养皿腔体及盖板的设计上，本发明设计的加样管或窗口包括了连续性灌流和一次性注射加 样两种加样方式，具有多种实际用途。其中，一次性注射加样对于实现快速去敏感化通道较 好的靶标响应质量具有明显的方法性保证。从而构建一种更好的细胞培养微环境且利于优 化细胞功能，同时可为快速检测药物响应情况提供了新方法和思路。
【附图说明】
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行 说明：
[0023] 图1为细胞培养皿结构示意图；