一种芽孢杆菌的发酵培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物制备技术领域，具体的说是一种芽孢杆菌的发酵培养方法。
【背景技术】
[0002]芽孢杆菌在自然界中广泛存在，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆能力，是一种理想的生防微生物。目前，芽孢杆菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。因此，采用芽孢杆菌用于作物病害的防治具有重要意义。目前国内众多芽孢杆菌类微生物制剂发酵企业的产品存在菌数较低的问题，一般发酵产品只有2-5X108CFU/mL，大大影响了产品的成本及质量。因此，提高芽孢杆菌发酵生产的活菌数及芽孢产量是十分必要的。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种芽孢杆菌的发酵培养方法。
[0004]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0005]—种芽孢杆菌的发酵培养方法:
[0006]I)菌种活化:将菌种在培养基中于30_37°C下活化培养24-48小时,待长出单菌落后，转接至固体斜面培养基上，培养得到菌体，待用
[0007]2)摇瓶发酵培养:将活化后的菌株制成菌悬液，而后按1-5%体积的接种量将芽孢杆菌菌悬液接种到摇瓶发酵培养基中，以200-300转/分钟的转速，30-37°C振荡培养15-24小时，即得摇瓶发酵培养液；
[0008]3)种子罐培养:将摇瓶发酵培养液按1%_5%体积接种量接入种子罐中，以0.8-1.5vvm的通气量通入无菌空气在30°C -37 °C、搅拌速率200_300rpm、罐压0.03-0.05Mpa、发酵培养16-24小时，得种子培养液；
[0009]4)按4%_5%体积的接种量将种子培养液接入发酵罐中，以0.8-1.5vvm的通气量通入无菌空气在30°C -37°C、搅拌速率200-300rpm、罐压0.05-0.1Mpa、发酵培养48小时，得到芽孢杆菌发酵液。
[0010]所述培养基和固体斜面培养基成分为牛肉膏0.3-0.5克、蛋白胨0.8-1.2克、氯化钠 0.3-0.5 克、琼脂 L 5-2 克，pH7.0-7.5，水 100mL。
[0011]所述步骤2)将活化后的菌株加入到无菌水中制成菌悬液，并调节菌悬液菌数为18 个 /mL。
[0012]所述步骤2)摇瓶发酵培养基的成分为:牛肉膏0.3-0.5克、蛋白胨0.8-1.2克、氯化钠 0.3-0.5 克、pH7.0-7.5，水 100mL。
[0013]所述步骤3)中种子罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入种子培养基后再121°C蒸汽灭菌30分钟，保压降温至30°C _37°C，而后接种摇瓶发酵培养液，种子培养基装量为罐体积的60-70%。
[0014]所述种子培养基成分为:蔗糖0.5-1克、蛋白胨0.8-1.2克、氯化钠0.3-0.5克、pH7.0-7.5,水 10mLo
[0015]所述步骤4)中发酵罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入发酵培养基后再121°C蒸汽灭菌30分钟，保压降温至30°C _37°C，而后接种种子培养液，发酵培养基装量为罐体积的60-70%。
[0016]所述发酵培养基成分为:蔗糖2克、蛋白胨I克、磷酸二氢钾0.2克、硫酸镁0.05克、硫酸亚铁0.01克、硫酸锌0.005克、NaCl0.5克、水100ml、pH7.0。
[0017]本发明所具有的优点:本发明发酵过程操作简单；使用的原料方便易得、价格低廉；发酵得到的芽孢杆菌发酵液菌数高、芽孢产率稳定，同时降低生产成本，为生防制剂的大规模生产和应用提供实用的发酵技术。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
[0019](I)菌种活化:从斜面中挑取一环芽孢杆菌菌种，在平板培养基上划线，于37°C培养箱中活化培养48小时，待长出单菌落后，转接至固体斜面培养基上，培养得到菌体。培养基配方为:牛肉膏0.3克、蛋白胨I克、氯化钠0.5克、琼脂2克，pH7.0，水100mL。
[0020](2)摇瓶发酵培养:将活化后的斜面菌种加入到无菌水中，做成菌悬液，调节菌悬液菌数为2.4X 18个/mL。按1%体积的接种量将芽孢杆菌接种到摇瓶发酵培养基中，220转/分钟，37°C振荡培养16小时，制得摇瓶发酵培养液。其中，摇瓶发酵培养基的成分为:牛肉膏0.3克、蛋白胨1.0克、氯化钠0.4克、pH7.2，水100mL。
[0021](3)种子罐发酵培养:将体积为500L的种子罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入300L种子培养基后再121°C灭菌30分钟，保压降温至30°C，将3L摇瓶发酵培养液接入种子罐，在搅拌速率为250rpm，罐压为0.05Mpa，风量为18m3/h，培养温度为37°C的条件下培养20小时，得种子培养液；其中种子培养基成分为:蔗糖I克、蛋白胨I克、氯化钠0.5克、ρΗ7.2,水 10mL0
[0022](4)发酵罐培养:先将体积为6m3的发酵罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入3m3发酵培养基后再121°C灭菌30分钟，保压降温至37°C，将120L种子培养液接入发酵罐中，在搅拌速率为300rpm，罐压为0.05Mpa，风量为240m3/h，培养温度为37°C的条件下培养48小时，得到芽孢杆菌发酵液。其中发酵培养基成分为蔗糖2克、蛋白胨I克、磷酸二氢钾0.2克、硫酸镁0.05克、硫酸亚铁0.01克、硫酸锌0.005克、NaCl0.5克、水100ml, pH7.0。
[0023](5)发酵液菌落计数:采用稀释涂布平板的方法对发酵液进行菌落计数，测得发酵液菌数为 4.33X 101QCFU/mL。
[0024]实施例2
[0025]与实施例1不同之处在于，培养的菌株也可是现分离获得的。
[0026]1.芽孢杆菌的获得:
[0027]从辽宁省沈阳市大民屯镇蔬菜大棚采集土样，取10克土样加入内装10ml无菌水的三角瓶中，于摇床上100转/分钟振荡20分钟，取ImL加入到9mL无菌水中进行稀释，得到稀释度为ΙΟ—1的土壤稀释液。依次进行稀释，得到10_2，?ο-3,10_4的土壤稀释液，将以上悬浊液于80°C水浴加热10分钟后，取0.1mL在牛肉膏蛋白胨培养基上涂布，每个浓度重复3次，置于30°C恒温箱中培养24h，得到芽孢杆菌单菌落，将其转入斜面保存。以尖孢镰刀菌为指示菌进行拮抗菌的筛选，得到可抑制植物病原真菌的芽孢杆菌。
[0028]2、高活性菌种的发酵
[0029](I)菌种活化:从斜面中挑取一环菌种，在平板培养基上划线，于37°C培养箱中活化培养24小时，待长出单菌落后，转接至固体斜面培养基上，培养得到菌体。培养基配方为:牛肉膏0.3克、蛋白胨I克、氯化钠0.5克、琼脂2克，pH7.0，水10mL0
[0030](2)摇瓶发酵培养:将活化后的斜面菌种加入到无菌水中，做成菌悬液，调节菌悬液菌数为1.8 X 18个/mL。按1%体积的接种量将芽孢杆菌接种到摇瓶发酵培养基中，200转/分钟，37°C振荡培养18小时，制得摇瓶发酵培养液。其中，摇瓶发酵培养基的成分为:牛肉膏0.5克、蛋白胨I克、氯化钠0.5克、pH7.0，水100mL。
[0031](3)种子罐发酵培养:将体积为500L的种子罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入300L种子培养基后再121°C灭菌30分钟，保压降温至30°C，将6L摇瓶发酵培养液接入种子罐，在搅拌速率为200rpm，罐压为0.05Mpa，风量为24m3/h，培养温度为37°C的条件下培养16小时，得种子培养液；其中种子培养基成分为:蔗糖I克、蛋白胨I克、氯化钠0.5克、ρΗ7.2,水 10mL0
[0032](4)发酵罐培养:先将体积为6m3的发酵罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入3m3发酵培养基后再121°C灭菌30分钟，保压降温至37°C，将150L种子培养液接入发酵罐中，在搅拌速率为250rpm，罐压为0.05Mpa，风量为300m3/h，培养温度为37°C的条件下培养48小时，得到芽孢杆菌发酵液。其中发酵培养基成分为蔗糖2克、蛋白胨I克、磷酸二氢钾0.2克、硫酸镁0.05克、硫酸亚铁0.01克、硫酸锌0.005克、NaCl0.5克、水100ml, pH7.0。
[0033](5)发酵液菌落计数:采用稀释涂布平板的方法对发酵液进行菌落计数，测得发酵液菌数为 6.23X 101QCFU/mL。
【主权项】
1.一种芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于: 1)菌种活化:将菌种在培养基中于30-37°C下活化培养24-48小时,待长出单菌落后，转接至固体斜面培养基上，培养得到菌体，待用； 2)摇瓶发酵培养:将活化后的菌株制成菌悬液，而后按1-5%体积的接种量将芽孢杆菌菌悬液接种到摇瓶发酵培养基中，以200-300转/分钟的转速，30-37°C振荡培养15-24小时，即得摇瓶发酵培养液； 3)种子罐培养:将摇瓶发酵培养液按1%_5%体积接种量接入种子罐中，以0.8-1.5vvm的通气量通入无菌空气在30°C -37°C、搅拌速率200-300rpm、罐压0.03-0.05Mpa、发酵培养16-24小时，得种子培养液； 4)发酵罐培养:按4%-5%体积的接种量将种子培养液接入发酵罐中，以0.8-1.5vvm的通气量通入无菌空气在30°C -37°C、搅拌速率200-300rpm、罐压0.05-0.1Mpa、发酵培养48小时，得到芽孢杆菌发酵液。2.按权利要求1所述芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于:所述培养基和固体斜面培养基成分为牛肉膏0.3-0.5克、蛋白胨0.8-1.2克、氯化钠0.3-0.5克、琼脂1.5-2克，pH7.0-7.5,水 10mL03.按权利要求1所述芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于:所述步骤2)将活化后的菌株加入到无菌水中制成菌悬液，并调节菌悬液菌数为18个/mL。4.按权利要求1所述芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于:所述步骤2)摇瓶发酵培养基的成分为:牛肉膏0.3-0.5克、蛋白胨0.8-1.2克、氯化钠0.3-0.5克、pH7.0-7.5，水10mL05.按权利要求1所述芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于:所述步骤3)中种子罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入种子培养基后再121°C蒸汽灭菌30分钟，保压降温至300C _37°C，而后接种摇瓶发酵培养液，种子培养基装量为罐体积的60-70%。6.按权利要求1或5所述芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于:所述种子培养基成分为:蔗糖0.5-1克、蛋白胨0.8-1.2克、氯化钠0.3-0.5克、pH7.0-7.5，水10mL07.按权利要求1所述芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于:所述步骤4)中发酵罐在121°C下蒸汽空消灭菌30分钟，装入发酵培养基后再121°C蒸汽灭菌30分钟，保压降温至300C _37°C，而后接种种子培养液，发酵培养基装量为罐体积的60-70%。8.按权利要求1或7所述芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于:所述发酵培养基成分为:蔗糖2克、蛋白胨I克、磷酸二氢钾0.2克、硫酸镁0.05克、硫酸亚铁0.01克、硫酸锌.0.005 克、NaCl0.5 克、水 10ml、ρΗ7.0。
【专利摘要】本发明属于微生物制备技术领域，具体的说是一种芽孢杆菌的发酵培养方法。具体为，将菌种在培养基中于30-37℃下活化培养24-48小时，待长出单菌落后，转接至固体斜面培养基上，培养得到菌体，待用；将活化后的菌株制成菌悬液，而后按1-5%体积的接种量将芽孢杆菌菌悬液接种到摇瓶发酵培养基中，以200-300转/分钟的转速，30-37℃振荡培养15-24小时，即得摇瓶发酵培养液；将摇瓶发酵培养液按1%-5%体积接种量接入种子罐中，以0.8-1.5vvm的通气量通入无菌空气在30℃-37℃、搅拌速率200-300rpm、罐压0.03-0.05Mpa、发酵培养16-24小时，得种子培养液；按4%-5%体积的接种量将种子培养液接入发酵罐中，以0.8-1.5vvm的通气量通入无菌空气在30℃-37℃、搅拌速率200-300rpm、罐压0.05-0.1Mpa、发酵培养48小时，得到芽孢杆菌发酵液。本发明操作简单、成本低、能够大规模生产，菌种最高芽孢产量为7×1010CFU/mL。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/07
【公开号】CN104928202
【申请号】CN201410108978
【发明人】张惠文, 李旭, 孙健, 苏振成, 李新宇
【申请人】中国科学院沈阳应用生态研究所
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年3月21日