胶质芽孢杆菌及其高密度发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，特别涉及对钾页岩矿粉分水解能力强的一种胶质芽孢杆菌及其发酵方法。
【背景技术】
[0002]钾页岩富含钾元素，是制造钾肥的重要矿物原料。地质调查表明，太行山和吕梁山蕴藏着数以亿吨计的钾页沉积岩。经化验，该地区的钾页岩不仅富含钾、磷、硫元素，还含有、铁、锌、铜、锰、钼、硼、砸、钠等多种植物生长需要的微量元素，非常适宜制备钾、磷农肥。然而，钾页岩中的钾盐、磷盐以矿化形态固持，不能被农作物直接吸收利用，需要相关微生物将其转化，纳入生物循环过程，使之成为作物可直接利用的绿色肥料。
[0003]胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)是娃酸盐细菌的一种，具有分解娃酸盐矿物、溶磷、解钾、固氮等作用，目前广泛应用于生物肥料、矿物分解、污水处理等领域。胶质芽孢杆菌在生长过程中生成的有机酸和荚膜多糖使其具有解钾和解磷能力、盐离子吸附能力和土壤颗粒的团聚能力。目前，国内外关于胶质芽孢杆菌的应用研宄主要集中在菌体增殖、矿物分解、生物絮凝等方面。这些研宄的预期目的不同，进行菌体增殖培养时，目的是获得高产量的芽孢；进行矿物分解时，培养基成分和培养条件应有利于矿物分解和矿物元素的浸出；进行生物絮凝时，主要关注的是与其荚膜多糖密切相关的絮凝剂的合成效率，因此胶质芽孢杆菌培养过程中考虑的因素、培养条件也各不相同。在这一方面没有比较意义。在菌体增殖培养方面，通过对培养条件的优化，目前的研宄进展是，2002年刘五星在“胶质芽孢杆菌发酵条件研宄”文章中报导，胶质芽孢杆菌NSOl菌株的发酵芽孢数能达到6.5 X 18 cfu/mL ；2006年吴向华在“胶冻样芽孢杆菌培养条件及发酵工艺的优化”的文章中，胶质芽孢杆菌100130的高密度发酵芽孢数为9.58X 108cfu/mL ；2007年胡秀芳在“胶质芽孢杆菌021120的培养条件及发酵工艺优化”文章中，胶质芽孢杆菌芽孢生成量为9.8 X 18Cfu/ mL ；2010年赵兵等人的“胶质芽孢杆菌PM13菌株低粘度、高产率的发酵生产方法”专利，芽孢数最高可达1.5X109cfu/mL，均达到和超过了我国农业行业标准硅酸盐细菌肥料NY 413-2000中规定的液态肥料产品的活菌数彡5X 18 cfu/mL的指标。
[0004]申请人长期从事钾页岩菌肥的研发，2009年申请的“生物矿质复混肥及其生产方法”获得授权(ZL200910073705.5)。为了进一步增加钾页岩的利用率，提高肥效，从矿区筛选野生型土著菌株，并进行了诱变育种和发酵技术研宄。
【发明内容】
[0005]本发明的目的有二，一是提供一种能够有效分解钾页岩矿的胶质芽孢杆菌，其菌数和芽孢转化率较高；二是提供该菌种的高密度发酵工艺。
[0006]本发明提供的一株胶质芽孢杆菌(BaciIlus muciIaginosus)，菌种保藏号为CGMCCN0.8481。该菌种原始菌株分离自山西省和顺钾页岩山洞岩床，将该菌株进行紫外诱变和等离子诱变处理，获得胶质芽孢杆菌诱变株mucilaginosus HSCUP-76-8)，经过革兰氏染色，芽孢染色，荚膜染色，鞭毛染色，电子显微镜观察及其他生理生化特性的测定，最后经过16SrDNA序列的比对分析，鉴定为胶质芽孢杆菌，定名Bacillusmucilaginosus HSC。该菌株已于2013年11月26日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏中心登记入册号为CGMCCN0.8481。该菌株具有良好的生产性状与应用性状，具体表现为:生长速率快发酵周期短，发酵时间为36~48小时；菌体浓度大，稳定期细胞数可达2.4X109 cfu / mL，最终芽孢数可达2.0X109cfu/mL ;芽孢转化率高，接近83%;存活时间长，成熟芽孢寿命达3年以上；解钾能力强达到2.6ug/mL。
[0007]本发明提供的一株胶质芽孢杆菌高密度发酵工艺，是指采用本发明提供的胶质芽孢杆菌诱变株mucilaginosus HSCUP-76-8)作为菌种的高密度发酵工艺，具体工艺步骤如下:
(1)菌种活化与斜面种子培养将胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8接种于斜面培养基进行活化，温度控制在29-33?，培养24-48小时，得到原始斜面种子，再将原始斜面种子接种于斜面培养基，相同条件培养，得生产斜面种子备用；
(2)摇瓶培养将生产斜面种子接种于摇瓶培养基中，在200-500mL的容器中装入20%-45%的摇瓶培养基，摇床培养温度29-33°C、转速160_220r/min、培养时间8_12小时，得种子液备用；
(3)种子罐培养将种子液接种于种子罐培养基，装料系数0.7-0.8，121°C蒸汽灭菌20分钟，接种量5%-10%，培养温度29?33°C，通气量为1.0:0.8-1.0 (v/v.min)，通过调节搅拌转速控制溶氧饱和度DO值10%?30%，pH控制在7.2±0.2，培养8?12小时，获得对数生长期种子液，在显微镜视野中细胞呈细长形，表现为着色力强，备用；
(4)第一阶段发酵培养将种子罐种子液接种于发酵基础培养基中，装料系数
0.7-0.8，121 °C蒸汽灭菌20分钟，接种量5%?10%，控制参数:温度29?33 °C，pH值7.0-7.2，通气量1:0.8-1.2 (v/v.min)，以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值20%?30%，以植物油为消泡剂控制泡沫；每间隔4小时取一次样，立即作镜检观察菌数及菌体形态，化验糖、氨态氮；根据检验结果适时补料，控制糖剂量为2g/L?3g/L、以NH4Cl控制氮源0.5g/L?0.lg/L，接近对数生长末期时停止补氮，此时，在显微镜视野中出现少数短粗状细胞为特征；
(5)第二阶段发酵培养控制参数:温度33~37°C，pH值7.2?8.9，通气量为1:
1.0-0.8 (v/v.min),以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值5%?10%，加入0.lg/L碳酸钙，促进芽孢形成，每间隔4小时取样，立即作镜检观察菌体形态，当镜检视野中的菌体形态全部芽孢时即为发酵终点，停止发酵，贮存备用。
[0008]所述的斜面培养基、摇瓶培养基、种子罐培养基，可以采用现有技术胶质芽孢杆菌使用的培养基，但本发明上述的培养基优选下列组成成分:
斜面培养基的组成成分为:蔗糖 2~5g、NaH2PO4 0.5~lg、MgSO4.7H20 0.2-0.5g、FeCl30.005g、CaCO3 0-0.lg、琼脂 20?30g，蒸馏水 lOOOmL，pH 7.0-7.4。
[0009]摇瓶培养基的组成成分为:蔗糖5~10g、NH4Cl 0.5~lg、NaH2PO4 1-1.5g、MgSO4.7H20 0.5?lg、FeCl3 0.005g、CaCO3 0.1-0.3g、蒸馏水 lOOOmL，pH 7.0-7.4。
[0010]种子罐培养基的组成成分为:蔗糖2~5g、淀粉3~10g、(NH4)2SO4 l~2g/ NH4Cl0.5~lg、酵母浸粉 l~2g、NaH2PO4 1~1.5g、MgSO4.7H20 0.5?lg、FeCl3 0.005g、蒸馏水lOOOmL，pH 7.0-7.4。
[0011]发酵基础培养基的组成成分为:蔗糖5g、(NH4)2SO4 l~2g/ NH4Cl 0.5~lg、酵母浸粉 I?2g、NaH2PO4 I?2g、MgSO4.7H20 0.5~lg, FeCl3 0.005g、蒸馏水 lOOOmL，pH 7.0-7.4 ；其中所述的蔗糖可以用同等糖量的玉米粉、淀粉任意一种代替，或同等糖量、不同比例的蔗糖、玉米粉、淀粉复合碳源替代。
[0012]本发明的胶质芽孢杆菌诱变株(ifeci77w5.mucilaginosus HSCUP_76_8)的解钾能力测定试验
(1)菌种活化与斜面种子培养:将胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8接种于本发明的斜面培养基进行活化，温度控制在30°C，培养36小时，得到原始斜面种子。再将原始斜面种子接种于相同的斜面培养基，相同条件培养，得生产斜面种子；
(2)摇瓶种子培养:将在斜面培养基上活化后的菌种接种于本发明的摇瓶培养基中，10mL培养基/250mL摇瓶，温度32°C，转速200r/min，摇床培养12小时，为母瓶种子，以母瓶种子再接种于相同的摇瓶培养基，相同条件培养，得摇瓶种子液；
(3)将本发明的摇瓶培养基按95mL分装并加入0.5g钾矿粉于250mL三角瓶，灭菌，在待测菌悬液中入摇瓶种子液，接种量5%，作三组平行并设置两组对照试验，对照组I不添加该菌种，对照组2为原菌肥中的解钾菌(解钾菌已活化)，在恒温摇床32°C，200r/min培养15小时，经离心取上清液4mL，与等体积6mmol/L的LiCl混合摇匀后，用火焰分光光度计测定钾的含量，测得结果如下:对照组I含钾为0.2ug/mL，对照组2含钾量为1.1 ug/mL，加胶质芽孢杆菌诱变株HSCUP-76-8的试验组含钾量2.6ug/mL。
[0013]本发明的有益效果
本发明的胶质芽抱杆菌〈Bacillus mucilaginosus) HSCUP-76-8，发酵时间在30?48小时内的芽孢数能达到1.6 X 1