一种温郁金细菌性枯萎病的致病菌株及分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从温郁金细菌性枯萎病植株上分离的一种新的致病菌株和分离方法， 以及由此菌株引起的枯萎病的鉴定方法。 技术背景
[0002] 郁金（拉丁学名：Curcuma petiolata)为姜黄属多年生宿根草本植物。根莖肉质， 肥大，黄色；叶基生，叶片长圆形，穗状花序圆柱形，蒴果3室。花期4~6月。郁金味辛、 苦，性寒。归肝、心、肺经，具有行气化瘀、清心解郁、利胆退黄、活血止痛、行气解郁、清心凉 血之用。郁金一般病症多生用，化痰开窍宜矾水炒。烹调用途：西厨中常添加于芥末中以增 香味。为印度常用的烹饪调味品。亦为"咖喱粉"原料之一。其主要生长于向阳的湿润田园 或水沟边，主产于浙江瑞安。具有活血止痛，行气解郁，清心凉血，利胆退黄之功效。现 代常用于治疗肝炎、高脂血症、胆囊炎、精神分裂症、癫痫、肿瘤等。温郁金是一种具有广泛 应用价值的植物资源，其根茎中抽提出来的挥发油中含有强烈抗癌活性物质，如β-榄香 烯具有抗癌的作用。
[0003] 随着农业经济产业模式的转型，农民大量种植温郁金，但由于土地资源的有限，使 得温郁金的生产过程中种植土壤长期连作，病原菌积累沿着，以及管理模式的粗放，导致温 郁金生产过程大量块茎因不知名的枯萎病害的发生而腐烂，经济损失严重，因此必须尽快 诊断该病害的病因，探寻防治该枯萎病的防治药剂及其综合治理技术，遏制该病害的扩展 蔓延，保障温郁金生产产业的持续稳定发展。
【发明内容】
[0004] 为了解决温郁金枯萎病害，本发明从枯萎病害植株上鉴定了一个特意的病原菌， 为防止该病找出了病因，为你防治该病的药剂筛选和开发提供了理论基础。
[0005] 经过一年来在温州种植基地的多次采样，病情的监测，并对该病害进行了病原分 离、镜检、纯化培养及rDNA ITS测序等多项研宄，已鉴定了该病害的病原。
[0006] -方面，本发明提供一种新的引起温郁金枯萎病的细菌菌株，该菌株被保藏在中 国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号码为CCTCC N〇:M2014489的茄科劳尔 氏菌28-1菌株。
[0007] 另一方面，本发明提供一种从温郁金上分离鉴定转化引起温郁金枯萎病的细菌菌 株28-1的方法，该方法包括如下步骤：
[0008] (1)切取温郁金上典型症状的病健交界处的少量的发病组织，经表面消毒后在NA 培养基上划线分离，平板在28°C下培养2天后，挑取代表单菌落，进行纯化培养，获得多个 纯化培养的单菌落，其中，培养的成分为：牛肉浸膏3g，酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，蔗糖 l〇g，琼脂17g，加水调制1L，调pH至7. 0 ;
[0009] (2)用获得的被保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号码 为CCTCC No:M 2014489的茄科劳尔氏菌28-1菌株对30盆温郁金进行盆栽致病性鉴定，方 法如下：28-1菌株在NA培养基上培养后，用无菌水稀释至0D600为1.0 ;采用针刺、注射等 方法在植株的茎基部接种，注射菌液的体积为Iml ;接种5-10天后可以看到明显的病症；首 先是叶片无光泽，呈略失水状，叶脉微变黄，叶缘向叶背卷曲；随后叶脉明显黄化，叶肉出现 黄斑，叶片萎焉明显，最后整个叶片黄化枯萎，因此该细菌分离物28-1为温郁金细菌性枯 萎病的病原物；块茎病部初呈水渍状，黄褐色，表面失去光泽，后逐渐软化，内部充满灰白色 汁液，表皮破裂后，流出污白色汁液；用无菌水接种的对照植株生长正常。
[0010] 对于保藏真菌的生物学特性说明
[0011] 该细菌菌株28-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号码为CCTCC No:M 2014489,地址：中国武汉武汉大学，拉丁学名：Ralstonia solanacearum 28-1，中文名称 为：茄科劳尔氏菌28-1，保藏日期为：2014年10月17日。
[0012] 有益效果
[0013] 本发明从温郁金上分离获得专化引起温郁金的枯萎病的致病性菌株，该菌株只对 姜科下的温郁金致病，而对其下的其他姜科植物，例如生姜，洋姜。
【具体实施方式】
[0014] 一、材料与方法
[0015] I. 1温郁金细菌性枯萎病病样的采集与镜检
[0016] 从浙江温州的温郁金种植基地采集温郁金细菌性枯萎病病叶、块茎等病样，放入 保鲜袋中置于4°C冰箱保存，待用；挑选典型症状的病茎叶、块茎，置于显微镜下进行镜检， 以健康叶茎部组织为对照。
[0017] 1. 2温郁金细菌性枯萎病病原菌的分离与致病性测定
[0018] 切取典型症状的病健交界处的少量发病组织，经表面消毒后在NA培养基（牛肉浸 膏3g，酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，鹿糖10g，琼脂17g，加水调制1L，调pH至7. 0)上划 线分离，平板在28°C下培养2天后，挑取代表单菌落，进行纯化培养，获得多个纯化培养的 单菌落。用针刺法将分离物回接至原寄主温郁金的块茎，以无菌水作为对照，重复3次。
[0019] 1. 3温郁金细菌性枯萎病菌基因组DNA提取及rDNA ITS序列扩增
[0020] 温郁金细菌性枯萎病菌28-1菌株（多个菌株种一个表现典型的菌株）送至上海 生工进行菌种鉴定，引物序列见表1，所用的试剂、试剂盒及测序均由上海生工完成。
[0021] 表1引物序列
[0022]
[0023] 1. 4不同浓度茄科劳尔氏菌对温郁金的致病性测定
[0024] 病原菌分离物28-1对1-2片叶的温郁金植株进行注射接种，采用的菌液浓度分别 为0D600为0. 5、0. 8、1. 0,注射菌量为lml。以无菌水为对照，试验重复3次。
[0025] 1. 5不同茄科劳尔氏菌的寄主专化性测定
[0026] 病原菌分离物28-1与姜青枯病菌SC56 (本实验室分离保存）分别同时注射接种 1-2片叶的温郁金和姜小苗茎干，菌液浓度0D600为1. 0,注射菌量为lml，测定不同病原物 对不同寄主植物的寄主专化性。以无菌水为对照，试验重复3次。
[0027] I. 6发病率与病情指数的计算方法
[0028] 温郁金细菌性枯萎病病级分级标准：
[0029] 0级：植株健康，无病症，生长正常；
[0030] 1级：植株叶片叶缘出现轻微发黄及失水状萎蔫；
[0031] 3级：植株叶片部分叶脉出现黄化，叶片失水状萎蔫较明显；
[0032] 5级：植株萎蔫明显，有1-2片叶片黄化枯萎；
[0033] 7级：植株萎蔫，或有3片及3片以上叶片黄化枯萎；
[0034] 9级：植株萎蔫枯死。
[0035] 发病率以"Ri"计，数值以" ％ "表示，计算公式：Ri = ni/ntX100(ni:发病株数； nt:总株数）病情指数以"DI"计，计算公式：DI =Σ (deXne)/(ntX3) X100(d。：相应病级； η。：各病级病株数；nt:总株数）。计算结果精确到小数点后两位。
[0036] 二、结果与分析
[0037] 2. 1温郁金细菌性枯萎病的症状
[0038] 4月中下旬温郁金种姜播种出土后就渐渐开始出现病症，初发病植株叶片呈轻微 缺水状萎蔫，失去光泽，叶尖，叶缘或叶脉间微微发黄；随着叶片的不断抽生，发病叶片不断 增多，症状也不断加重，上部叶片缺水状萎蔫明显，下部叶片的着生角度变大，叶片向叶背 反卷，中脉渐渐黄化，叶缘、叶尖、或叶面随机的出现不规则黄斑；随着病情加重，叶片黄化 加重加深