一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药原料生产技术领域，具体涉及一种能催化丁香酚生成阿魏酸工程菌株、构建方法及生物转化方法。
【背景技术】
[0002]阿魏酸(Ferulic Acid)的化学名称为4_羟基_3_甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一。由于阿魏酸可以作为微生物发酵生产香兰素的前体物质，以及其所具有的抗氧化、抗血栓形成、降血脂、调节人体免疫功能等特性，阿魏酸及其衍生物被广泛应用于降血月旨、防治冠心病和癌症、抗菌消炎、抗突变、活血通络、消除黄褐斑，以及失眠、腰酸腿沉等的医学治疗，保健品生产和食品添加剂领域。
[0003]工业上可以利用香兰醛和丙二酸为原料，通过缩合反应化学合成阿魏酸。但该法反应时间长，且生产的为反式和顺式阿魏酸的混合物，不易分离，同时化学合成法在环境污染方面存在一定问题。
[0004]申请号为2008101636038的一种天然阿魏酸的制备方法，公开日为2009年5月20日，公开的阿魏酸的制备主要通过物理化学方法从米糠等天然产物中提取，其过程包括乙醇洗涤、100°c高温氢氧化钠强碱水解、硫酸酸化沉淀等步骤。该传统生产方法的提取工艺复杂，涉及多步高耗能、重污染的环节，产生大量的酸碱废弃物和废水；同时由于米糠中阿魏酸含量较低，最终提取获得的产品得率不足0.2%，以上种种因素极大地限制了阿魏酸应用产业的发展。
[0005]在微生物体内，阿魏酸可以通过一系列代谢途径合成。如催化丁香酚的氧化反应逐步代谢合成，经香兰醇氧化酶催化生成松柏醇，松柏醇经松柏醇脱氢酶催化生成松柏醛，松柏醛最终经松柏醛脱氢酶催化获得阿魏酸。(Highly Efficient B1transformat1nof Eugenol to Ferulic Acid and Further Convers1n to Vanillin in RecombinantStrains of Escherichia col1.Jorg Overhagej Alexander Steinbuchelj and HorstPriefert，Applied and Environmental Microb1logy，2003，6569-6576)在上述反应中，松桕醇脱氢酶的酶促反应需要氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，松桕醛脱氢酶的酶促反应需要氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，因此这两种辅酶在转化过程中不断消耗，同时生成的还原型辅酶反馈抑制酶的催化效率，导致中间产物松柏醇、松柏醛大量积累，产能较低，不具有工业化生产价值。在生产转化过程中添加相应的辅酶，即NADP和NAD可以有效地解决氧化型辅酶不足的问题，大幅度提高阿魏酸生物转化的效率和产量，但由于此类辅酶价格昂贵，稳定性低，投加大量辅酶不具有应用可行性。根据生物催化反应过程的经济性和工业可行性，必须提供高效、低成本的辅酶再生系统，把辅酶从还原态再生为氧化态，从而使辅酶保持在一定的催化剂量水平。
[0006]来源于树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖还原酶，可以高效地催化木糖生成木糖醇(Engineering Escherichia coli for Xylitol Product1nFrom Glucose-Xylose Mixtures.Patrick C.Cirinoj Jonathan W.Chin, Lonnie0.1ngram, B1technology and B1engineering)。该酶促反应可以同时利用还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，将二者再生为氧化态辅酶，底物木糖价格低廉、安全无毒，应用于辅酶再生系统中，可以有效地实现辅酶的平衡，大幅度提高氧化还原酶催化反应的效率。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种高效生产阿魏酸的工程菌株，同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶。
[0008]本发明的另一个目的在于提供一种阿魏酸生产工程菌株的构建方法，系统运用酶耦联法同时催化两个平行的酶促氧化还原反应体系，一个酶体系催化底物转化，另一个酶体系催化辅酶循环再生。体系一中的香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶通过三步氧化反应最终催化合成阿魏酸，同时消耗大量氧化型辅酶NAD和NADP，产生相应还原型辅酶。体系二能够超量表达高活性木糖还原酶，催化木糖生成木糖醇，并将体系一中不断积累的还原型辅酶NADH和NADPH循环再生，以维持整个生物转化系统的辅酶平衡，促进氧化还原酶促反应的可持续进行，大幅度提高产物阿魏酸的转化率和产量。
[0009]本发明还有一个目的在于提供一种阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法。
[0010]本发明提供的一种阿魏酸生产工程菌株，同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶，其中，香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因、松柏醛脱氢酶基因和木糖还原酶基因上游分别整合T7启动子，在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录。
[0011]本发明提供的一种阿魏酸生产工程菌株的构建方法，包括以下步骤:
[0012](I)、用Nde I和Bam HI分别双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA，1683bp)、松柏醇脱氢酶基因(calA，768bp)、松柏醛脱氢酶基因(calB，1446bp)和木糖还原酶基因(xyl, 957bp)，克隆至用Nde I和Bam HI酶切过的pET24a载体上，得重组载体pET24a_vaoA，pET24a_calA、pET24a_calB 和 pET24a_xyl ；
[0013](2)、将重组载体pET24a_vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为900bp片段，与上述载体连接、转化，得重组载体 pET24a-vaoA_calA ；
[0014](3)、将重组载体pET24a-vaoA_calA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为1.6kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体 pET24a-vaoA-calA_calB ；
[0015](4)、将重组载体pET24a_xyl用Bam HI和HindIII酶切，回收作为载体，PET24a-vaoA-calA-calB用Bgl II和HindIII酶切，回收大小为4.1kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体 pET24a-xyl-vaoA-calA_calB (pET24a_XVAB)；
[0016](5)、将重组载体pET24a_XVAB转入BL21 (DE3)，得预期工程菌。
[0017]摇瓶培养发酵，采用大肠杆菌在下述条件下培养和发酵
[0018]I)种子培养基(质量百分比)和培养条件:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠I %，余量为纯净水。37°C培养16小时，摇床转数为200rpm。
[0019]2)发酵培养基:蛋白胨1.2%，酵母提取物2.4%，甘油0.4%，磷酸二氢钾0.23%，磷酸氢二钾1.25%，余量为纯净水。
[0020]3)发酵培养条件:按发酵体积I %量接种，37°C培养，摇床转数为200rpm ;接种2小时后，降温至25?28°C加入终浓度0.6mM IPTG，继续培养8小时。
[0021]阿魏酸的生物转化
[0022]I)发酵培养结束后，4°C下4000rpm离心收集菌体。
[0023]2) 10mL磷酸缓冲液悬浮菌体，转入250mL转化瓶中，同时添加0.06mL的丁香酚底物和ImL 0.lg/mL木糖。
[0024]3)生物转化条件:25°C反应，摇床转数为200rpm，每小时添加0.06mL的丁香酚和ImL 0.lg/mL 木糖。。
[0025]4)转化结束，通过高效液相色谱(HPLC)检测阿魏酸产量和纯度。
[0026]高效液相色谱法检测阿魏酸含量
[0027]I)取转化液25 μ L，加入475 μ L甲醇充分混匀，溶解产物。
[0028]2)样品在4°C低温下1000rpm离心5min，取上清液。
[0029]3)上清液通过0.45 μ m滤头过滤，取滤液待测。
[0030]4)高效液相色谱色谱条件:色谱柱为Diamonsil-C18(250mmX4.6mm, 5 μπι);流动相为68:3