一种卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种卵母细胞培养液及培养方法。
【背景技术】
[0002] 获取高质量的体外成熟卵母细胞是动物胚胎体外生产、转基因克隆等胚胎工程技 术成功与否的前提和关键。尽管近年来卵母细胞体外成熟技术取得了长足的进步，然而成 熟卵母细胞体外发育能力较体内卵母细胞仍然低很多。卵母细胞体外成熟过程中受外界环 境的影响，非常容易发生应激损伤，导致发育能力下降。
[0003] 维生素 B12又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素，维生素 B 12是B族维生素中 迄今为止发现最晚的一种。自然界中的维生素 B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造 维生素 B12。维生素 B12是惟一的一种需要肠道分泌物（内源因子）帮助才能被吸收的维生 素，它在肠道内停留时间长，大约需要三小时（大多数水溶性维生素只需要几秒钟）才能被 吸收。维生素 B12是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成1个 咕啉大环（与卟啉相似），是维生素 B12分子的核心。所以含这种环的化合物都被称为类咕 啉。维生素 B12为浅红色的针状结晶，易溶于水和乙醇，在pH值4. 5~5. 0弱酸条件下最稳 定，强酸（pH〈2)或碱性溶液中分解，遇热可有一定程度破坏，但短时间的高温消毒损失小， 遇强光或紫外线易被破坏。维生素 B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫 血；防止大脑神经受到破坏等；但目前维生素 B12都是通过肠胃吸收后再进入生命体内被利 用，尚未有维生素 B12直接作用于体外细胞尤其是卵母细胞的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有卵母细胞体外发育能力低的问题，提供一种卵母细胞体外成熟 培养液及培养方法。
[0005] 本发明卵母细胞体外成熟培养液由卵母细胞常规培养液和维生素 B12、胎牛血清、 FSH、LH、17 β -雌二醇、丙酮酸钠、EGF、青霉素及硫酸链霉素组成；卵母细胞体外成熟培养 液中维生素 B12的浓度为2mg/ml、血清的浓度为0. lml/ml、卵泡刺激素的浓度为0. 05IU/ ml、黄体生成素的浓度为0. 〇5IU/ml、17 β -雌二醇的浓度为1 μ g/ml、丙酮酸钠的浓度为 24. 2mg/L、表皮生长因子的浓度为10ng/ml、青霉素的浓度为100IU/ml、硫酸链霉素的浓度 为 100 μ g/ml〇
[0006] 利用上述卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法：
[0007] 将卵母细胞放入预热的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5% 的环境内成熟培养20~24小时，即获得成熟的卵母细胞。
[0008] 本发明卵母细胞体外成熟培养液体外成熟培养小鼠和牛卵母细胞可有效提高受 精或孤雌激活后的早期胚胎发育率；牛卵母细胞体外受精囊胚率达到36%以上，孤雌激活 囊胚率达到22%以上；小鼠卵母细胞体外受精囊胚率达到55%以上，孤雌激活囊胚率达到 34%以上。
[0009] 本发明卵母细胞体外成熟培养液可明显提高卵母细胞体外成熟后胚胎发育能力， 而且成本低廉，便于广泛推广。
[0010] 本发明卵母细胞体外成熟培养液能够减少外界环境带来的应激损伤，促进卵母细 胞的细胞质成熟，提高了体外成熟的卵母细胞孤雌激活和受精后的胚胎发育能力。
[0011] 本发明卵母细胞体外培养方法简单，效果好，周期短。
【具体实施方式】
[0012] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0013] 一：本实施方式卵母细胞体外成熟培养液由卵母细胞常规培养液和 维生素 B12、胎牛血清、FSH、LH、17 β -雌二醇、丙酮酸钠、EGF、青霉素及硫酸链霉素组成；卵 母细胞体外成熟培养液中维生素 B12的浓度为2mg/ml、血清的浓度为0. lml/ml、卵泡刺激素 (FSH)的浓度为0.05IU/ml、黄体生成素（LH)的浓度为0.05几/1111、17|3-雌二醇的浓度为 1 μ g/ml、丙酮酸钠的浓度为24. 2mg/L、表皮生长因子（EGF)的浓度为10ng/ml、青霉素的浓 度为100IU/ml、硫酸链霉素的浓度为100 μ g/ml。
【具体实施方式】 [0014] 二：本实施方式与一的不同点是：卵母细胞常规培养 液为DMEM培养液、TCM199培养液或MEM培养液。其它步骤及参数与实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0015] 三：本实施方式与一或二的不同点是：血清为小牛血 清、胎牛血清或新生牛血清。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
【具体实施方式】 [0016] 四：本实施方式卵母细胞体外成熟培养液按以下步骤培养卵母细 胞：
[0017] 将卵母细胞放入预热的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5% 的环境内成熟培养24小时，即获得成熟的卵母细胞。
【具体实施方式】 [0018] 五：本实施方式与四的不同点是：卵母细胞为GV期卵 母细胞。其它步骤及参数与实施方式四相同。
【具体实施方式】 [0019] 六：本实施方式与四或五的不同点是：卵母细胞体外 成熟培养液预热1~3小时。其它步骤及参数与实施方式四或五相同。
【具体实施方式】 [0020] 七：本实施方式与四至六之一的不同点是：卵母细胞 体外成熟培养液置于35~40°C的环境中预热。其它步骤及参数与实施方式四至六之一相 同。
【具体实施方式】 [0021] 八：本实施方式与四至七之一的不同点是：培养牛卵 母细胞，卵母细胞体外成熟培养液置于38. 5°C的环境中预热。其它步骤及参数与实施方式 四至七之一相同。
【具体实施方式】 [0022] 九：本实施方式与四至八之一的不同点是：培养小鼠 卵母细胞，卵母细胞体外成熟培养液置于37°C的环境中预热。其它步骤及参数与实施方式 四至八之一相同。
[0023]
【具体实施方式】十：本实施方式与【具体实施方式】四至九之一的不同点是：100 μ 1的 卵母细胞体外成熟培养液中放入30 μ 1卵母细胞。其它步骤及参数与实施方式四至九之一 相同。
[0024] 实施例1
[0025] 卵母细胞体外成熟培养：
[0026] -、配制卵母细胞体外成熟培养液：准确称取维生素 B12IOOmg,先用25ml的TCM199 培养液（购自GIBCO公司）溶解，然后向培养液中加入5ml胎牛血清和5000IU青霉素及 5000 μ g链霉素，轻微搅拌混匀，再加入FSH 2. 5IU、LH 2. 5IU、17 β-雌二醇50 μ g、丙酮酸 钠 I. 21mg和EGF 500ng，轻轻混匀，静置2~3小时后，用0. 22 μ m的过滤器抽滤消毒后，分 装到I. 5ml离心管中，4°C下储存，备用。
[0027] 二、体外培养：将小鼠 GV期卵母细胞放入37°C预热2小时的卵母细胞体外成熟培 养液中，然后置于CO2体积浓度为5%的环境内成熟培养24小时；将牛GV期卵母细胞放入 38. 5°C预热2小时的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5%的环境内成 熟培养24小时。
[0028] 三、体外受精或孤雌激活，胚胎继续培养7天，培养48小时记录2-细胞胚胎及 4-细胞胚胎比率：
[0029] 其中，孤雌激活：小鼠卵母细胞采用SrCl2激活，小鼠 GV期卵母细胞先在含IOmM SrClJP CB的无钙CZB中培养2. 5h，再在含有CB的含钙CZB中培养3. 5h，之后转移至CZB 中继续培养，培养48小时至4-细胞胚胎期转移至含糖CZB中培养至囊胚；
[0030] 牛卵母细胞采用inomycin激活，牛GV期卵母细胞先在含5 μ M inomycin的CRl 中激活5分钟，再在含6-DMAP的CRl的培养液中继续培养4小时，之后转移至CRl中培养， 培养48小时发育至4-细胞胚胎期阶段再换到CRl中继续培养至囊胚。
[0031] 体外受精：选取性成熟（10~12周龄）昆明白雄鼠，已通过交配实验证明其有 受精能力，颈椎脱白法处死，从附睾尾和输精管收集精子，将收集的精子团块置入Iml含