具有低转化副产物的麦芽糖淀粉酶的突变体及突变方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有低转化副产物的麦芽糖淀粉酶的突变体及突变方法，属于基 因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 麦芽糖是由两个葡萄糖单位经α-1，4糖苷键连接组成的还原性二糖，化学名称 是4-0-D-六环葡萄糖基-D-六环葡萄糖。其甜度柔和，又因低粘度、低吸湿性及良好的热稳 定性等特点，可作为食品增甜剂取代葡萄糖和蔗糖，在食品工业领域具有巨大的应用潜力。 高麦芽糖浆是一种以麦芽糖为主（麦芽糖含量超过45%)的糖浆。在食品工业中的用途之 一是制作糕点、糖果等产品。糖浆熬煮温度远高于饴糖，一般超过140°C。麦芽糖含量大于 70%，甚至高达90%以上，则被称为超高麦芽糖浆。麦芽糖相比葡萄糖可避免血糖升高，对 于应用于抗体、疫苗等的制备具有优于葡萄糖的应用优势。因此超高纯度的麦芽糖浆在医 药领域的应用也引起了越来越多的关注。
[0003] 工业上高麦芽糖浆的生产，是以淀粉质为原料，经过α -淀粉酶，麦芽（或β -淀 粉酶，真菌淀粉酶）水解工艺制得的。当前较为成熟的工艺，已经可以制备麦芽糖含量至少 高达70%的超高麦芽糖浆，葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖以及部分低聚糖和糊精是主要的转 化副产物。为获得更高纯度的麦芽糖浆或纯麦芽糖，需要对淀粉水解获得的麦芽糖浆进行 后续的产物提取和纯化。反应产物中的糊精和部分低聚糖可通过乙醇沉淀去除，而麦芽三 糖、四糖等小分子糖，则要通过色谱分离等方法去除。色谱分离基本可去除葡萄糖和四糖及 以上的小分子糖类，但产物中的麦芽三糖由于与麦芽糖性质较为相近且含量较高，往往成 为分离纯化中的主要杂质，不仅直接降低了产品纯度，还给麦芽糖结晶性、糖浆粘度以及最 终产品的水分含量带来很大不利影响，使麦芽糖最终收率大大降低。因此需要获得麦芽三 糖含量尽可能低的初始麦芽糖浆，以简化麦芽糖提取纯化步骤，降低高麦芽糖浆的生产成 本。
[0004] 麦芽糖淀粉酶具有小分子糖水解活性，可水解麦芽三糖等小分子糖，形成葡萄糖 和麦芽糖，因此在高麦芽糖浆制备中通常与α -淀粉酶、β -淀粉酶和普鲁兰酶等复配使用 以降低副产物比例。据报道，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus) 的麦芽糖淀粉酶具有较高的最适反应温度和较低的最适pH反应条件，可满足较为苛刻的 工业生产条件，使产物中麦芽糖比例显著提高，在工业上有极大的应用优势。但发明人在前 期应用中发现，由于该酶同时具有的水解活性和转苷活性，在水解小分子糖的过程中，又会 转苷生成新的三糖。生产中为了减少副产物的生成，往往需要延长反应时间使水解反应达 到平衡，一方面导致生产周期长、效率低，另一方面反应时间的延长，又容易导致生成的麦 芽糖被重新利用形成转苷副产物。
[0005] 因此，本发明利用蛋白质工程和酶工程手段，降低麦芽糖淀粉酶的转苷活性，以减 少转化体系中的副产物比例，使该酶具有更高的麦芽糖制备效率，赋予其在工业上更好的 应用性能。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种麦芽糖淀粉酶的突变体，该突变体是B. stearothermophilus 麦芽糖淀粉酶催化活性中心受体结合位点上的氨基酸残基的取代，与天然麦芽糖淀粉酶相 比，在高麦芽糖浆制备中具有更快的转化效率以及更少的转化副产物。
[0007] 所述麦芽糖淀粉酶的氨基酸序列与NCBI数据库中的B. stearothermophilus麦芽 糖淀粉酶氨基酸序列一致（NCBI编号：1QH0_A)。
[0008] 所述的突变体是将天然麦芽糖淀粉酶基因中第177位的色氨酸（Trp)分别突变成 了苯丙氨酸（Phe)、酪氨酸（Tyr)、亮氨酸（Leu)、天冬氨酸（Asn)和丝氨酸（Ser)，分别命名 为 W177F、W177Y、W177L、W177N 和 W177S。
[0009] 本发明突变体W177F、W177Y、W177L、W177N和W177S分别用于高麦芽糖浆制备时， 在相同酶转化条件下，终产物中麦芽糖含量分别为90. 38%、90. 64%、91. 11%、91. 26%和 91.46%，麦芽三糖含量分别为1.10%、1.11%、0.62%、0.27%和0.19%;突变体11771^、 W177N和W177S反应体系在9h时达到反应平衡。而天然酶应用于高麦芽糖浆制备时，终产 物中麦芽糖含量为89. 34%，麦芽三糖含量为3. 15%，在IOh基本达到反应平衡。由此可见， 突变体W177F、W177Y、W177L、W177N和W177S应用于高麦芽糖浆制备时，相比天然酶明显降 低了反应副产物麦芽三糖的含量，提高了麦芽糖制备效率，缩短了反应平衡时间，对于简化 色谱分离纯化过程具有重要意义，在超高麦芽糖浆的制备中具有潜在应用优势。
【附图说明】
[0010]图1天然麦芽糖淀粉酶和突变体制备高麦芽糖浆过程中麦芽糖含量变化 [0011] 图2天然麦芽糖淀粉酶和突变体制备高麦芽糖浆过程中麦芽三糖含量变化
[0012] 图3天然麦芽糖淀粉酶和突变体的最适温度
[0013] 图4天然麦芽糖淀粉酶和突变体的60°C温度稳定性
[0014] 图5天然麦芽糖淀粉酶和突变体的最适pH
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 :本例说明天然麦芽糖淀粉酶的制备。
[0016] (1)麦芽糖淀粉酶重组菌的构建
[0017] 根据NCBI数据库中B. stearothermophilus来源的麦芽糖淀粉酶氨基酸序列 (NCBI编号：1QH0_A)，对麦芽糖淀粉酶的基因序列以大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优 化，将优化后的基因 amyM采用化学全合成方法合成。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是 pET24a (+)。将pET24a (+)质粒和带有amyM基因的质粒分别进行Nco I和Hind III双酶切， 酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞， 转化产物涂布于含30mg · Γ1卡那霉素的LB平板，经37°C培养过夜，平板上挑取2个单菌 落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒验证，结果正确，得到富集的amyM/pET24a质粒。将 质粒amyM/pET24a转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑取转化子在LB液体培养基（含 30mg · Γ1卡那霉素）中37°C培养过夜，保存甘油管，命名为amyM/pET24a/BL21 (DE3)。
[0018] (2)麦芽糖淀粉酶的表达与纯化
[0019] 从甘油管接种amyM/pET24a/BL21 (DE3)于LB液体培养基（含30mg · Γ1卡那霉 素）生长8h，按5%接种量将种子接入TB液体发酵培养基（含30mg · Γ1卡那霉素）。大 肠杆菌在37 °C培养2h后，加入0.0 lmM终浓度的IPTG进行诱导，并在25 °C摇床继续培养发 酵48h后，将发酵液于4°C、8, OOOXg离心10min除菌体，收集发酵上清。
[0020] 在上清液中缓慢加入50 %硫酸铵，4°C放置过夜，4°C、8, 000 X g离心20min，收集 沉淀。用pH 7. 5的20mM磷酸缓冲液复溶沉淀后，在20mM磷酸缓冲液中透析过夜。期间更 换2-3次缓冲液。通过0. 22 μ m膜过滤后制成上样样品，采用avant蛋白纯化仪进行重组 蛋白的纯化。阴离子交换色谱纯化步骤：（1)平衡：用5倍体积的20mM缓冲液平衡DEAE阴 离子交换色谱柱；（2)上样：预先处理好的样品以ImL · HiirT1的流速上样；（3)洗脱：流速 ImL · rniiT1进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分步收集含麦芽糖淀粉酶活力的洗脱液。得 到纯化的天然麦芽糖淀粉酶。
[0021] 实施例2 :本例说明麦芽糖淀粉酶突变体制备。
[0022] (1)定点突变
[0023] 在B. stearothermophilus来源的麦芽糖淀粉酶与环状芽孢杆菌（B. circulans strain 251)来源的环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase)序列比对分析的基础上，对麦芽糖 淀粉酶的蛋白质结构进行模拟分析，选取麦芽糖淀粉酶活性中心受体结合位点的氨基酸设 计突变。将麦芽糖淀粉酶第177位的色氨酸（Trp)分别突变成了苯丙氨酸（Phe)、酪氨酸 (Tyr)、亮氨酸（Leu)、天冬氨酸（Asn)和丝氨酸（Ser)，分别标记为W177F、W177Y、W177L、 W177N 和 W177S。
[0024] 引入W177F突变的定点突变引物为：
[0025] 正向引物：5' -GCGATATTTCTAACTTCGACGACCGCTACGAA-3' (下划线为突变碱基）
[0026] 反向引物：5' -TTCGTAGCGGTCGTCGAAGTTAGAAATATCGC-3' (下划线为突变碱基）
[0027] 引入W177Y突变的定点突变引物为：
[0028] 正向引物：5' -GCGATATTTCTAACTATGACGACCGCTACGAA-3' (下划线为突变碱基）
[0029] 反向引物：5' -TTCGTAGCGGTCGTCATAGTTAGAAATATCGC-3' (下划线为突变碱基）
[0030] 引入W177L突变的定点突变引物为：
[0031] 正向引物：5' -GCGATATTTCTAACCTAGACGACCGCTACGAA-3' (下划线为突变碱基）
[0032] 反向引物：5' -TTCGTAGCGGTCGTCTAGGTTAGAAATATCGC-3' (下划线为突变碱基）
[0033] 引入W177N突变的定点突变引物为：
[0034] 正向引物：5' -GCGATATTTCTAACAATGACGACCGCTACGAA-3' (下划线为突变碱基）
[0035] 反向引物：5' -TTCGTAGCGGTCGTCATTGTTAGAAATATCGC-3' (下划线为突变碱基）
[0036] 引入W177S突变的定点突变引物为：
[0037] 正向引物：5' -GCGATATTTCTAACTCCGACGACCGCTACGAA-3' (下划线为突变碱基）
[0038] 反向引物：5' -TTCGTAGCGGTCGTCGGAGTTAGAAATATCGC-3' (下划线为突变碱基）
[0039] 利用上述引物，以81^11^^了24&质粒为模板，进行？〇?反应。反应均在50以1^体系 中进行，反应条件为：94°C预变性4min ;随后进行30个循环（94°C，10s ;55°C，10s ;72°C， 7min 20s) ;72°C延伸IOmin;最后4°C保温。PCR产物经Dpn I (Fermentas公司）消化，分 别转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含30mg · Γ1卡那霉素的LB平板，经 37°C培养过夜，平板上挑