一组耐螯合剂乙二胺四乙酸的重组碱性木聚糖酶及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于工业酶开发利用领域，特别涉及一组耐螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA) 的重组碱性木聚糖酶和其编码基因，及其构建方法。 技术背景
[0002] 造纸工业是世界上六大污染工业之一，我国造纸行业年排放废水量达40万吨，占 全国工业废水排放量的1 / 6。多年来，人们不懈地努力，试图开发出无污染和高效率的制 浆造纸新工艺，以减少污染，保护环境。造纸工艺中的制浆和漂白工序是污染物产生的主要 工序。生物技术可以帮助解决这些问题，其中最具吸引力和挑战性的是生物制浆和生物漂 白。因为造纸工业废水主要由蒸煮黑液和漂白废液组成，采用生物制浆和生物漂白可以有 效减少这些废液的产生。传统的化学漂白法是采用多段的氯/二氧化氯漂白及碱提取来去 掉木质素，在废水中会含有大量含氯的、致癌致畸的物质，如呋喃、二噁英等，造成严重的环 境污染和生态破坏。80年代初，西方工业国家工业污染控制战略出现了重大变革，以污染预 防取代了污染治理。芬兰率先将生物漂白技术引进纸浆造纸工业中。用木聚糖酶对纸浆进 行预漂白，可以减少随后的化学漂白用氯量30 %-40 %，废液中有机氯化物与毒化物含量 显著减少。酶法助漂新工艺在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造 纸工业应用最成功的一例。采用基因工程与蛋白质工程手段获得性质优良的耐热耐碱耐化 学试剂的木聚糖酶已成为各相关实验室的研究热点。
[0003] 木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶是可将 木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它在饲料、造纸、食品、能源工业和环境科学上有 着广阔的应用前景。目前一些国家已经开展使用木聚糖酶漂白纸浆，如欧洲、北美、南美、日 本等，将酶作为工业漂白预漂剂。木聚糖酶助漂新工艺已成为发达国家造纸工业中较为成 熟的生物技术，在加拿大有超过10%的硫酸盐漂白浆采用了木聚糖酶漂白。1986年，在国 际造纸工艺生物技术研讨会上，芬兰人Viikari等首次报道，松木和桦木Kraft楽经过木 聚糖酶预处理后可以降低漂白氯耗，提高白度。
[0004] 本发明前期研究的碱性木聚糖酶基因 XynA来源于短小芽孢杆菌Baci I Ius pumilus，含有687bp的开放阅读框，编码228个氨基酸，通过信号肽预测工具SignalP分 析，显示该氨基酸序列含有27个氨基酸的信号肽。将该基因的成熟片段xynA-M在大肠杆 菌中进行了表达，表达所得成熟木聚糖酶经纯化后进行酶学性质的研究表明，这种碱性木 聚糖酶在pH9. 2、60°C和5mMEDTA条件下，酶活显著降低。
[0005] 在工业应用中，大部分碱性木聚糖酶不具备耐螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA)的能 力，在造纸漂白工艺中，据芬兰统计，其国内超过1 / 2的化学浆厂和2 / 3的机械浆厂在 使用螯合剂。随着 TCF (Total Chlorine Free)和 ECF (Elemental Chlorine Free)漂白流程 以及水封闭循环的更广泛应用，EDTA在全世界的用量有不断增加的趋势，对螯合剂的研究 也得到更多地重视，因此，获得更多高效、稳定的耐EDTA的碱性木聚糖酶有利于推动木聚 糖酶在溶解纸浆和漂白纸浆生产中发挥重要作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提出一组高效、稳定的耐乙二胺四乙酸（EDTA)的重组碱性木聚 糖酶及编码基因，及其构建方法。
[0007] 本发明是这样实现的。在GenBank收录号EU421717. 1中含有的木聚糖酶基因 xynA，对应木聚糖酶XynA的氨基酸序列收录号为ACA00160. 1，除去N-段的27个氨基酸信 号肽，剩下的201个氨基酸是该木聚糖酶的成熟片段XynA-M，对应的木聚糖酶基因成熟片 段是xynA-M。针对xynA-M，分别设计点突变引物（FP1 :、1^14?2、1^2、？?3和1^3，序列如 下）进行定点诱变。利用突变引物FPl和RPl将公布的基因56、57位的鸟嘌呤G分别变成 腺嘌呤A和胸腺嘧啶T，利用突变引物FP2和RP2将公布的基因将56、57位的鸟嘌呤G分 别变成胸腺嘧啶T和胞嘧啶C，利用突变引物FP3和RP3将公布的基因将55、56和57位的 胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G分别变成胞嘧啶C、腺嘌呤A和胞嘧啶C，使得编码的木聚糖酶的成熟 肽第19位的色氨酸W分别突变成酪氨酸Y、苯丙氨酸F和组氨酸H，获得一组耐5~IOmM EDTA 的重组碱性木聚糖酶基因 xynA-M-W19Y、xynA-M-W19F 和 xynA-M-W19H。
[0008] 重组碱性木聚糖酶基因 xynA-M_W19Y的氨基酸序列具体如下：
[0011] 其G、G分别变A、T的DNA序列如下：[0012]
[0009]
[0010]
[0013] 重组碱性木聚糖酶基因 xynA-M-W19的氨基酸序列具体如下：
[0014]
[0015] 其G、G分别变T、C的DNA序列如下：
[0016]
[0017] 重组碱性木聚糖酶基因 xynA-M-W19H的氨基酸序列具体如下：
[0018]
[0019] 其T、G、G分别变C、A、C的DNA序列如下：
[0020]
[0022] 本发明的重组碱性木聚糖酶蛋白质XynA-M-W19Y、XynA-M_W19F和XynA-M_W19H构 建方法，具体包括如下步骤：
[0023] 1)采用化学全合成或PCR方法克隆得到xynA (收录号ACAOO160. 1)，其氨基酸序 列如下面SEQ NO. 1所示：
[0024] SEQ No. 1
[0025]
[0026] 其中，该酶基因编码201个氨基酸，N端27个氨基酸为信号肽序列如下面SEQ NO. 3 所不：
[0027] SEQ No. 3
[0028] 1MNLKRLRLLF VMCIGFVLTL TAVPAHA27
[0029] 因此，成熟的碱性木聚糖酶XynA-M理论分子量为22KDa，其氨基酸序列如下面SEQ NO. 2所示：
[0030] SEQ No. 2
[0031]
[0032] 设计引物FP和RP，并分别引入BamHI、HindiII酶切位点，采用PCR方法分离克隆 了成熟木聚糖酶基因 xynA-M，全长606个碱基（包括终止密码子），将基因 xynA-M用限制 性内切酶BamHI和HindlII酶切处理，琼脂糖凝胶电泳胶回收，得到酶切产物xynA-M ;
[0033] FP ：CGCGGATCCGAGACAATCTACGACAACCG
[0034] RP ：CCCAAGCTTCTGCAGTTATCTGCCGATC
[0035] 2)将步骤1)获得的酶切产物xynA-M连接到用两种同样限制性内切酶酶切过的大 肠杆菌表达载体pET28a (+)上，得到重组载体pET28a-xynA-M ;
[0036] 3)分别设计将成熟肽的第19位氨基酸W突变成Y的点突变引物FPl和RP1，将第 19位氨基酸W突变成F的点突变引物FP2和RP2,以及将第19位氨基酸W突变成H的点突 变引物FP3和RP3 :
[0037] FPl :5' CTTCGAGCTGTATAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3'
[0038] RPl :5, TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3'
[0039] FP2 :5, CTTCGAGCTGTTCAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3'
[0040] RP2 :5, TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3'
[0041] FP3 :5, CTTCGAGCTGCACAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3'
[0042] RP3 :5' TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3'
[0043] 将步骤2)获得的重组载体pET28a-xynA_M作为模板进行全质粒反向PCR，体系为： 5XFast Pfu Buffer，10y I ;dNTP，5y 1 ;模板 pET28a-xynA，0. 3μ 1 ;10μΜ 的点突变引物 卩？$?1、卩？2、卩卩3)和1^〇^1、1^2、1^3)各1.5以1，卩&8七？包，0.5以1，加灭菌(1(1!120至5(^1。 (空白对照：将以上体系中的DNA模板换成ddH20,其他不变）
[0044] PCR 扩增条件为 95°C / 2 分钟；95°C / 30 秒，55°C / 30 秒，72°C / 3 分钟，35 个 循环；72°C / 10 分钟，4°C / ^。
[0045] 4)将步骤3)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒 回收PCR片段，用限制性内切酶DpnI和T4多聚核苷酸激酶（PNK)对回收的PCR片段 进行模板消解和磷酸化，体系为：DpnI, 1 μ I ;PNK，1 μ 1，IOXFerments Digest Buffer, 2 μ I ;dATP2 μ I ;PCR 片段，10 μ 1，加灭菌 ddH20 至 20 μ 1。37 °C 处理 12 小时，70 °C 处 理 15 分钟灭活后，向上述体系中加入 T4Ligase Bufier，ly I ;PEG4000，ly I ;T4Ligase， ΙμL。置于22°C金属浴保温30分钟后，直接转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态 细胞中，各挑选两个转化子经测序验证后，分别得到含点突变的重组载体的重组菌株 BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19Y、BL21(DE3) / pET28a-xynA-M-W19F 和 BL21(DE3) / pET28a-xyhA-M-W19H ；
[0046] 5)将重组菌株 BL21 (DE3) / pET28a-xyhA-M-W19Y、BL21 (DE3) / pET28a-xynA-M-W19F 和 BL21 (DE3) / pET28a-xynA-M-W19H 按照常规的大肠杆菌诱导表达 重组蛋白方法，获得重组蛋白XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H，测定木聚糖酶的 活性。
[0047] 本发明采用定点突变技术将短小芽孢杆菌Bacillus pumilus的碱性木聚糖酶成 熟肽编码基因 xynA-M进行定点突变并克隆连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，转化到 大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态中，筛选重组子表达菌株，经诱导表达、破菌、纯化获 得突变体蛋白XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H(附图1)，测定突变体蛋白的活 性，发现突变体是一组耐EDTA、酶活稳定的碱性木聚糖酶，该重组木聚糖酶突变体在OmM、 lmM、5Mm、10mMEDTA(pH9. 2,60°C)条件下，酶活有明显的递增趋势，而原始酶XynA-M酶活有 下降趋势（附图2)。其中，IOmM EDTApH9. 260°C条件下XynA-M-W19Y比酶活比XynA-M高接 近20%，这为碱性木聚糖酶的广泛应用奠定了良好的基础。
[0048] 本发明通过定点诱变技术提高了碱性木聚糖酶的耐EDTA的活性。这种碱性木聚 糖酶的推广应用，不仅在工业生产发展中产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生 巨大的生态效益。例如在造纸工业的生物助漂中，利用高效的，耐EDTA的碱性木聚糖酶，可 减少漂白用化学助剂的使用，节约大量工艺用水、生产时间、能耗、原料及对废水的处理费 用，减少对环境排放水中的盐含量及C0D，最大程度的保护生态环境。
【附图说明】：
[0049] 附图1 :重组木聚糖酶纯化的SDS-PAGE电泳检测。M-蛋白质分子量标准；1-4 :分 别是 XynA-M、XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F 和 XynA-M-W19H 纯化后酶液；5-8 :分别是 XynA-M、 XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F 和 XynA-M-W19H 发酵粗酶液；
[0050] 附图 2 :XynA-M、XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和 XynA-M-W19H蛋白在pH为 9. 2、60°C 及不同EDTA浓度下的相对酶活。
【具体实施方式】
[0051] 以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。
[0052] 实施例一
[0053] 本发明公开了一组耐EDTA的碱性木聚糖酶和编码基因，其特征在于在GenBank收 录号EU421717. 1中含有的碱性木聚糖酶基因 xynA，对应木聚糖酶xynA的氨基酸序列收录 号为ACAOO160. 1，除去N-段的27个氨基酸信号肽，剩下的201个氨基酸是该木聚糖酶的成 熟片段XynA-M，对应的木聚糖酶基因成熟片段是xynA-Μ。针对xynA-M，分别设计点突变引 物（FP1、RP1、FP2、RP2、FP3、RP3)进行定点诱变