大豆春化基因GmVRN1及其克隆方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于资源与环境技术领域，具体涉及一种大豆春化基因 GmVRNl及其克隆 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 大豆起源于中国，自古以来一直是我国主要的粮油作物之一。大豆籽粒中含有丰 富的蛋白质和脂肪，是重要的植物蛋白质和食用油脂的来源，因而具有很大的经济价值。近 年来，随着分子生物学和分子遗传学的发展，植物发育生物学的研宄取得了长足的进展。在 分子水平上逐步地揭示花发育的本质成为研宄者的目标，因此，与开花相关的新基因的挖 掘和功能探宄不仅有助于解析花发育过程或者反应通路，同时对于作物改良也意义深远。
[0003] 近几年，科学家们通过正向、反向遗传学等研宄手段去挖掘调控花期的基因，而对 于典型的光周期敏感型作物一大豆，研宄者更多专注于光周期途径基因的研宄。尽管大豆 开花不需要春化处理，但比较基因组学的研宄表明，在大豆基因组中仍保留了春化途径的 基因，这些基因的功能却鲜有研宄。本研宄在实验室前期研宄的基础上，解析了大豆春化 途径基因 GmVRNl的相关功能，丰富了大豆花期调控的理论，对今后的大豆遗传改良奠定基 础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于利用比较基因组学探索大豆基因组中春化途径的相关基因，运 用real-time PCR技术对AtDREBlA转基因大豆进行春化途径基因差异表达的筛选，提供一 种大豆春化基因 GmVRNl的克隆方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述克隆方法获得的大豆春化基因 GmVRNl。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述大豆春化基因 GmVRNl的应用；所述的应用为大 豆春化基因 GmVRNl参与调控花期的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大豆春化基因 GmVRNl的 克隆方法：应用引物 F :5-CGCGGATC CATGAGAGACTTTTCATTTCAT-3 ;引物 R : 5-CGGGGTACCCTAATGTGGTGCAC-3 进行反转录 PCR，94°C 3min 预变性，94°C 变性 30s，59°C 退火 45s，72°C延伸lmin，34个循环后72°C再延伸IOmin ;在栽培大豆华春5号中克隆了 GmVRNl， 长度为1863bp，包含175bp的5'非翻译区，383bp的3'非翻译区和1305bp的开放式阅读 框。
[0008] 一种大豆春化基因 GmVRNl由上述克隆方法获得，其核苷酸基因序列如下所示：
[0009] ATGAGAGACTTTTCATTTCATTCCAATGATTTATTAATCTTGCAAGGAAACAACAGAGAGAGGTGGAAG ATGGATTATCATCAGGACAACCCTGCAGTTTTCTTCACTACCATCAAGAACACCAAGCAACTGAAAGTCCCAGAGGA GTTTCTGAAGCATTTGAATAAAGACTTGTGGAGTAATTCAGTTCTTATAGGCCCTTCTGGTGATAAGTGGCAAGTAA CTATTTTGAAGAAAGGAAATAACGTGTATATGGACAATGGTTGGTCACAATTTCTGAAAGACAATTCAGTGGTGCTT GATGAGTTCTTGCTTTTTACATATCATGGAGGAAACTGCTTCTATGTTCAAATTTTTGGTGGGAATGGATTGGAGAG GCTATGCCGCAAAGAAGCAAGAGAAGAACAAGCTGCTACCCCTCAATTTTTTGATCTGCCTTTCAGCAACAAAGCCT CAATTTCTGATGGATGTGAGATAAAGAAAACAAGACAAGAACAAGCTTCTGCCCCAAGTTTGGCGAGGACAAACAAG AGCAAGCAAAGAAAAACTTTTGTCGGTTCATCACACCTCCATGAATCGAACTCTTACAAAAAAGATCTGCCTTCCAG CAACAAAGGCACACTTTCTAAAGGATGTGAGATAAAGAAAACAAGACAAGAACAAGCTGCCACCCCAAGTTTTTTGA GGCCAAATAAGATTAAACAAAGAAAAACTTCTGCCAGATCATCAAACCTCAATGAATCCAAATCTTGTCAAGAAGGA CAAGAACGAGTTGCCACCCTAAGTTGGGCGAGGACAAATAATTATAACAGTACGCAAAGAAAAACTTCAGCCGGTTC ATCACACCTGCATGAATCGAATTCTTCCAAAGAAGATCTTCCTTTCAGCAACAAAGCCTCACTTTCTAAGGACTTCC CAAAGCCTCAGAGTTCAATTAATATTGAATGTTCAGAAGCATGTAAATTGGCCGAGTCTTTTACCTCTCGGAATCCT CATTGGAAGCACCTTTTGACAAAATGCAATTTGGAACGGTGCATCTTGCTTATTGCTGCTGAGTTTGCCAGAAAGTA CATTCCTGAAGCACTGGAACAGATCTATCTTTGGAATTCGGAAGGAAAATCTTGGGAAGTGCGAGTGCATTATTTTA GAAATCGAAATACATGGTATGCTGCGTTTAAGAGAGGATGGGAAAGATTCGTTCGTGATAACAAGCTCATGAAAGGT GACACTTGCATTTTTGAAGTTGAAGAAGAACAAGGCCATTGGAGTGTTCACATATTCAGAACCGGATGTGCACCACA TTAG0
[0010] 上述的大豆春化基因 GmVRNl在参与调控花期中的应用。
[0011] 上述的大豆春化基因 GmVRNl在参与调控花期中的应用，通过采用转基因拟南芥 来实现大豆春化基因 GmVRNl参与花期调节的应用；具体通过春化途径调控拟南芥的开花。
[0012] 所述的采用转基因拟南芥为采用花药侵染法转化拟南芥来实现。
[0013] 上述的大豆春化基因 GmVRNl的克隆方法，和通过采用转基因拟南芥来实现大豆 春化基因 GmVRNl参与花期调节，具体包括以下步骤：
[0014] (1)大豆GmVRNl基因的克隆：华春5号大豆种子植株培养，TRIzol提取法进行RNA 的提取，通过设计的引物进行反转录及目的基因的克隆，连接pZeroBack/Blunt vector载 体进行测序；
[0015] (2)拟南芥为载体来实现大豆春化基因 GmVRNl参与花期调节试验：首先进行拟南 芥的遗传转化，GmVRNl基因转化拟南芥阳性植株的筛选，拟南芥春化途径和自主途径的基 因以及下游的关键基因进行定量PCR验证。为了进一步了解GmVRNl的功能，我们构建了过 量表达载体对拟南芥进行异源转化。得到的TO代种子经含有20mg/L潮霉素的筛选培养基 中培养，10天后把具有抗性的苗移入营养土中。得到Tl代后，取以上13株Tl代植株叶片 提取基因组总DNA，用质粒DNA作阳性对照，野生型植株DNA和水作阴性对照，扩增潮霉素基 因。同时，为了解析GmVRNl引起转基因拟南芥植株早花的分子机制，我们选择了拟南芥春 化途径和自主途径的基因以及下游的关键基因进行定量PCR验证。
[0016] 检测结果显示，一个诱导开花的基因 Glymallgl3220. 1的序列信息从Phytozome V. 9. 1数据库获得，并命名为GmVRNl。我们以栽培大豆华春5号为材料，提取RNA并反转录 成cDNA，设计引物克隆出了 GmVRNl的⑶S序列。它的长度为1863bp的基因，包含了 175bp 的5'非翻译区，383bp的3'非翻译区和1305bp的开放式阅读框。测序后进行比对，GmVRNl 的序列和William 82参考序列一致。除此之外，GmVRNl编码434个氨基酸，含有2个B3DNA 结构域，分别位于40-120和334-429的位置。进化树分析结果显示，GmVRNl在大豆中存在 序列一致性很高的同源基因，但这些基因的功能都未被研宄过。除此之外，我们还发现该基 因的同源基因主要存在于双子叶植物中，尤其是豆科植物，但是在低等植物、微生物、动物 中都未发现，这说明该类基因是高等植物特有的。尽管GmVRNl和拟南芥VRNl同源性不是 很高，但是它们都含有2个保守的B3 DNA结合域，这暗示了两者在功能方面可能存在相似 性。
[0017] 检测结果显示，我们构建了过量表达载体对拟南芥进行异源转化。得到的TO代种 子经含有20mg/L潮霉素的筛选培养基中培养，10天后把具有抗性的苗移入营养土中。得到 Tl代后，取以上13株Tl代植株叶片提取基因组总DNA，用质粒DNA作阳性对照，野生型植 株DNA和水作阴性对照，扩增潮霉素基因。结果表明，10株拟南芥植株能扩增出与阳性对照 相同大小的DNA条带，初步证明了目的基因 GmVRNl已整合在拟南芥的基因组中。同时进行 了野生型拟南芥植株相比，转基因拟南芥植株春化途径基因 VIN3、开花促进因子FT、花芽 分化基因 APl显著上调，而开花抑制因子FLC、FD的表达量显著下调。因此，我们推测转基 因植株早花是由于花期抑制因子FLC受到抑制，揭示GmVRNl可能通过春化途径调控了拟南 芥的开花。
[0018] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019] 1、本发明通过Phytozome V. 9. 1数据库获得一个诱导开花的基因 Glymallgl3220. 1的序列信息，并命名为GmVRNl，并在栽培大豆华春5号中克隆了 GmVRNl， 长度为1863bp，包含175bp的5'非翻译区，383bp的3'非翻译区和1305bp的开放式阅读 框。
[0020] 2、本发明克隆了大豆春化基因 GmVRNl，并对其调控花期的功能进行应用。本发明 包括大豆春化基因 GmVRNl的克隆及PCR引物设计与反应条件，同时还包括了对利用转基因 技术来阐述大豆春化基因 GmVRNl参与调控花期的应用。
[0021] 3、本发明首次将GmVRNl在拟南芥中过量表达，并证实了该基因是一个功能蛋白 质，并通过春化途径调控开花。
【附图说明】
[0022] 图1为琼脂糖凝胶电泳检测扩增出来的GmVRNl基因的CDS序列检测结果图； M, DL2000 DNA maker ; 1-2, GmVRNl